Con el fin de comparar la actividad de las elongasas de ácidos grasos entre los
diferentes tipos celulares del epitelio seminífero, se empleó un PUFA conocido, el [3H]20:4n-
6 (ácido araquidónico tritiado), para detectar la formación de PUFA más largos, esto es, de 22 y hasta 32 átomos de carbono, a partir de él. Antes de cultivar cada grupo de células por separado (SC, EP, ER y ET), para asegurar las condiciones necesarias (medios, tiempos de incubación) que permitieran la supervivencia de las mismas durante las largas horas a las que se las sometería en cultivo en presencia de 2.5 µM 20:4n-6, se hicieron ensayos preliminares, utilizando preparaciones de células intratubulares totales (CT), para determinar su viabilidad. Las CT fueron cultivadas en medio DMEM sin glucosa y con el agregado de diferentes suplementos durante varias horas (hasta 20) a 33°C (Figura 19 en la sección Figuras y Tablas- Capítulo II). Durante estos ensayos se determinó, para cada condición, el número de células sobrevivientes y muertas mediante tinción con ioduro de propidio (IP),
como se detalla en el apartado 12.1 de esta sección. Estas y otras determinaciones previas
(por ej., número de horas de cultivo necesarias para que ocurriera una elongación de
[3H]20:4 detectable) permitieron emplear las condiciones de cultivo que se describen a
continuación.
Los túbulos seminíferos adultos (TS), las células germinales (EP, ER y ET) y las
células de Sertoli (SC) fueron resuspendidos en medio DMEM (del inglés Dulbecco's
modified Eagle's medium) sin glucosa (Gibco®, 11966025), suplementado con 5% (v/v) de
suero fetal bovino (SFB, Gibco®), lactato 6 mM, penicilina (100 U/ mL) y estreptomicina (100
U/ mL) y sembrados en cápsulas de cultivo de 35 mm de diámetro. Se utilizaron 5 X106
células (en el caso de los TS, se empleó una cantidad equivalente a 1.5 mg de proteína), en un volumen final de 2 mL de medio por cápsula. En todos los casos se agregó 1 µCi de
[3H]20:4n-6 radiomarcado (65.9 Ci/mmol; Perkin Elmer Life Sciences Inc, Boston, MA, USA)
a cada cápsula, previamente combinado con 20:4n-6 no marcado, preparando la mezcla marcado-no marcado en DMEM suplementado con BSA libre de ácidos grasos (relación BSA/ 20:4n-6 total = 1:2, mol/ mol, y concentración final de 20:4n-6, 2.5 µM por cápsula). Los túbulos y las células se incubaron a 33ºC en atmósfera húmeda controlada con 5% de
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Transcurridas las 20 horas de incubación con [3H]20:4n-6, los TS y las células en
suspensión fueron transferidas a tubos de vidrio, raspando las cápsulas y lavándolas dos veces con PBS 1X frío. Mediante centrifugación (800 g por 5 minutos), los TS y las células
fueron separados del medio conteniendo productos marcados con [3H], lavados y
recuperados de los pellets para la extracción de los lípidos, realizada como se detalla para
muestras no marcadas más atrás en esta sección (apartado 6.1). Los extractos lipídicos
obtenidos se secaron bajo corriente de N2, y se conservaron a -20°C hasta el momento de
su uso, disueltos en 500 µL de cloroformo: metanol (2:1, v/v).
10.2. Medición de la incorporación y distribución del [3H]20:4n-6
Desde los extractos lipídicos se tomaron alícuotas para determinar la incorporación
total de [3H]20:4n-6 en cada muestra. Se sembró el volumen del extracto equivalente a
50000 dpm (del inglés disintegrations per minute) en placas de TLC para la separación de
las principales clases de lípidos polares (fosfolípidos) y de lípidos neutros, como se detalla
para los lípidos no marcados en el apartado 6.4 de esta sección. Dadas las grandes
diferencias tanto entre los tamaños de las muestras como entre los niveles de incorporación del precursor, para una localización de los lípidos más precisa y homogénea sobre las placas de TLC, antes de la siembra en las mismas se agregó a las muestras, a modo de carrier, un volumen conocido de un extracto de lípidos de testículo de rata sin marcar. Las clases de lípidos se visualizaron luego de la exposición de las placas a vapores de iodo y las
manchas resultantes se rasparon y transfirieron a viales. La radioactividad incorporada se
midió mediante contaje por centelleo líquido como se detalla en el apartado 6.7 de esta
sección, y se normalizó por el contenido de proteína de los TS y los distintos tipos celulares.
10.3. PUFA y VLCPUFA sintetizados a partir de [3H]20:4n-6
A partir de los extractos lipídicos totales de TS, SC, EP, ER y ET, se tomaron alícuotas que contuvieran un total de 50000 dpm. Se prepararon metil ésteres (ME) a partir de los AG de los lípidos totales presentes, y se purificaron mediante TLC como se detalló antes en esta
sección (apartado 6.5). Las preparaciones de ME fueron separadas en primer lugar de
acuerdo a su número de dobles ligaduras mediante cromatografía de impregnación argéntica (Ag-TLC) y posteriormente de acuerdo a la longitud de su cadena mediante
cromatografía líquida de alta presión (HPLC, del inglés high performance liquid
chromatography) de fase reversa. Esta parte del estudio fue realizada con la colaboración del Dr. Daniel A. Peñalva, quien diseñó la estrategia de separación y a quien se le proporcionaron los ME de las muestras para resolver.
Para ello, se utilizaron placas de TLC de 20 x 20 cm preparadas con 10 g de sílica gel
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solvente. Previo a la siembra, los ME se mezclaron con una cantidad conocida de ME de ácidos grasos tetraenoicos y pentaenoicos de distinta longitud de cadena no marcados,
preparados previamente para que sirvieran como carriers. Las bandas conteniendo las
fracciones de ME tetraenoicos y pentaenoicos fueron visualizadas bajo luz UV luego de rociar las placas con DCF al 0.05% en metanol, se rasparon y se eluyeron de la sílica (como
se explica en el punto 6.4 de esta sección). El volumen del eluido se redujo bajo corriente
de N2, se filtró para remover trazas de material particulado, se secó bajo N2 y se
resuspendió en metanol.
Figura 8. Separación mediante HPLC de especies de ME de AG no hidroxilados tetraenoicos y pentaenoicos de lípidos totales de testículo de rata, en función de su número de carbonos (20 a 32). Para los AG pentaenoicos se incluye una magnificación del cromatograma en el rango de los tiempos de retención correspondientes a los componentes minoritarios 31:5n-6 y 32:5n-6. mUA, miliunidades arbitrarias.
Luego, las especies de ME componentes de las fracciones de ME tetraenoicos por una parte, y de ME pentaenoicos por otra, fueron separadas de acuerdo con la longitud de su
cadena por HPLC, como se muestra en los cromatrogramas de la Figura 8, utilizando un
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columna analítica (Zorbax Eclipse Plus C18, 4.6 x 100 mm) empaquetada con partículas de 3.5 µm de diámetro. El solvente empleado como fase móvil fue acetonitrilo: agua (98:2, v/v) bombeado isocráticamente a un flujo de 0.75 mL/minuto. Los ME poliinsaturados fueron detectados por su absorbancia a 203 nm y colectados a medida que emergieron de la columna. Cada una de las fracciones colectadas se llevó a sequedad y se midió su radioactividad mediante centelleo líquido.
11. ESTUDIOS SOBRE LA BIOSÍNTESIS DE ESFINGOLÍPIDOS