NEO interception and trajectory optimisation

Un cop s’han triat els marcadors STRs lligats a cadascuna de les mutacions, dissenyat els encebadors tant per a la detecció directa com indirecta i s’han adquirit comercialment mitjançant la síntesi de les seqüències demanades (Biomers.net) cal que es testi la seva fiabilitat, de manera preliminar, utilitzant DNA genòmic de la família candidata al DGP.

Com s’ha comentat amb anterioritat, el DNA genòmic el podem obtenir a partir de o bé sang perifèrica o bé d’epiteli bucal extret amb uns raspallets específics per a aquesta

funció (Catch-All Sample Collection Swabs d’Epicentre), aquesta segona opció

s’utilitza en cas de dificultat de dur a terme una extracció de sang o bé quan es veu dificultat el transport refrigerat de les mostres sanguínies. En qualsevol dels dos casos

  58  

al disseny, es procedeix a realitzar l’estudi d’informativitat de la mutació concreta i al genotipat dels marcadors STRs de la família, utilitzant DNA de cadascun dels membres dels que en disposem: generalment d’ambdós membres de la parella i idealment, de cadascun dels seus progenitors a més d’algun familiar directe afectat de la patologia. Aquest sistema permet verificar la correcta detecció directa de les mutacions en DNA de la família, i establir el lligament familiar i determinar el grau d’informativitat de cadascun dels marcadors STRs per triar els d’informativitat més elevada i per tant més adequats.

Per optimitzar el protocol per a cada família s’ha de conèixer la temperatura òptima de cada parella d’encebadors dels STRs informatius. Per això es duu a terme una PCR aplicant un gradient de temperatures entre 53-63ºC en un termociclador per a cadascun dels marcadors utilitzant DNA genòmic de la família com a motlle. A partir de la

observació dels pics resultants de l’electroforesi capil·lar per a cada temperatura es

determinen la/les temperatures òptimes per a cada parella d’encebadors. Aquest sistema de gradient de temperatures també s’aplica per a la detecció directa de les mutacions. A partir d’aquest moment s’agrupen STRs segons la temperatura òptima d’hibridació dels seus encebadors i es posen a punt les PCRs múltiplex corresponents, utilitzant com

a material de partida DNA amplificat a partir de cèl·lules aïllades.

En alguns casos s’ha pogut disposar de limfòcits aïllats, obtinguts de cultius de sang dels diferents membres de les famílies candidates al DGP i s’ha pogut posar a punt el

protocol en aquestes cèl·lules aïllades. Alternativament, s’han utilitzat limfòcits de les

línies cel·lulars Coriel GM07381 i GM11285 ambdues amb un cariotip 46, XY i

portadores de la mutació ΔF508 causant de fibrosi quística.

Un cop aconseguits els resultats desitjats, cal valorar l’eficiència del protocol, tenint en compte la taxa d’amplificació, i la taxa d’ADO (percentatge dels locus en el que un dels

al·lels no s’ha amplificat). Per això a partir del DNA amplificat de 30 cèl·lules, de les

que coneixem el genotip, es valora tant la taxa d’amplificació com d’ADO per determinar la fiabilitat del protocol posat a punt. Un cop validat el protocol i finalitzat l’estudi d’informativitat, s’envia el corresponent informe al cntre de reproducció

col·laborador i la família candidata al DF-DGP. A partir d’aquell moment ja es poden

3.6.5. Aplicació dels procediments desenvolupats i optimitzats a casos

clínics concrets

Per a la aplicació dels procediments desenvolupats en el DF-DGP s’ha treballat amb

blastòmers biopsiats dins del Programa de Fecundació In Vitro de Diagnòstic Genètic

Preimplantacional (FIV-DGP) dels centres col·laboradors: Fundació Puigvert i Clínica

Eugin. En aquests casos, la biòpsia ha estat realitzada per embriòlegs de cada un dels centres, i d’acord amb la disponibilitat metodològica disponible: biòpsia amb àcid de Tyrode o biòpsia amb làser.

La biòpsia química, utilitzant àcid Tyrode, consisteix en dissoldre químicament una

petita regió de la zona pel·lúcida. Un cop realitzada l’obertura, es pot treure el

blastòmer amb l’ajuda una pipeta de biòpsia.

Per a la biòpsia física, en canvi, s’utilitza una làser (Saturn Laser R1) acoblat a un microscopi amb l’equipament de micromanipulació (Nikon Eclipse TE200). Un cop ben

col·locat l’embrió es centra la zona on volem que incideixi el làser i s’hi fan un o dos

polsos per tal de perforar la zona pel·lúcida, a continuació es biopsien els embrions

utilitzant una pipeta de biòpsia.

En qualsevol dels dos casos, l’eficiència i la rapidesa de la biòpsia són factors molt importants per intentar mantenir la millor qualitat embrionària i dels blastòmers biopsiats. En cas de que algun blastòmer es lisi, s’ha de procedir a canviar la pipeta de biòpsia per evitar contaminacions de DNA entre embrions diferents.

Després de la biòpsia, es fan 4 rentats del blastòmer, en gotes de PBS/0,1% PVA dins d’una cabina de flux i sota el control de la lupa binocular (Wild Heerbrugg M8 a 50x). Un cop rentats, es diposita cada blastòmer a l’interior d’un tub de PCR que es marca adequadament. També s’agafa una mostra de l’última gota de rentat com a control negatiu de cadascun dels blastòmers. En els casos clínics és imprescindible utilitzar gotes noves per a cadascun dels blastòmers biopsiats per evitar contaminacions. A

continuació els tubs amb les cèl·lules i els controls negatius corresponents són

mantinguts a 4ºC en gel fins a l’arribada al laboratori, en què es deixaran durant un mínim de 15 minuts a -80ºC per augmentar l’efectivitat de la posterior lisi.

  60