Aunque el análisis mutacional era antes la parte final del estudio de pacientes AF, y aportaban la confirmación final del diagnóstico y del subtipo del paciente, la implementación de nuevas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento permiten actualmente realizar el subtipaje y estudio mutacional a la vez. No
69 obstante, debido a que la población de pacientes AF muestran un espectro mutacional bastante amplio y variado, lo dicho anteriormente no es del todo cierto. En este sentido, existe una gran diversidad de mutaciones reportadas en varios estudios de determinación del espectro mutacional realizados en distintas poblaciones en los cuales han venido cada vez identificado mutaciones antes no reportadas (Castella et al., 2011a; Kalb et al., 2007; Levran et al., 2005b; Savino et al., 2003; Yagasaki et al., 2004). Por lo cual se hace necesario junto al estudio mutacional realizar estudios funcionales de complementación génica para las mutaciones nuevas que se vayan identificando. Esto no es cierto para algunos grupos altamente consanguíneos dónde una mutación determinada presenta un efecto fundador. Existen ejemplos muy claros de este fenómeno en diferentes poblaciones. En la población española de individuos de etnia gitana, dónde la mutación c.295C>T en FANCA hace que esta población tenga la frecuencia de portadores de AF más elevada del mundo (1/67) (Callén et al., 2005). Estos efectos fundacionales no son exclusivos de etnias altamente consanguíneas sino que también se han observado en otras poblaciones como es el caso de la población brasileña, dónde se ha reportado que el 50% de las mutaciones encontradas en el gen FANCA corresponden a la mutación c.3788_3790delTCT (Magdalena et al., 2005). Estos efectos fundacionales hacen que en algunas poblaciones algunos grupos de complementación en particular estén más representados. En algunos genes AF y especialmente en
FANCA, son muy comunes las deleciones intragénicas, que pueden incluir
desde un exón a la totalidad del gen. Las deleciones pueden representar hasta un 40% de las mutaciones encontradas en este gen en determinadas poblaciones, y muy frecuentemente, se asocian a recombinaciones entre repeticiones Alu (Callén et al., 2004; Castella et al., 2011a; Morgan et al., 1999).
Una herramienta importante de resaltar en este aspecto es la base de datos creada por la Dra. Auerbach, la “Fanconi Anemia Mutation Database” (http://www.rockefeller.edu/fanconi/mutate/). Desde su creación ha tenido como objetivo registrar todas las mutaciones encontradas en pacientes AF de todo el mundo que hayan sido publicadas. Gracias a esta base de datos se puede asignar rápidamente la patogenicidad a muchas de las mutaciones que
70 actualmente se están identificando en las diferentes poblaciones que se están estudiando. Adicionalmente, se permite hacer una idea de manera más global del espectro mutacional de cada grupo de complementación. Por ejemplo, para el gen FANCA, FANCC y FANCG se han registrado hasta la fecha 489, 56 y 54 mutaciones distintas, respectivamente.
Las técnicas usadas para la detección de las mutaciones se han venido renovando con la incorporación de nuevas técnicas y mejor tecnología. Entre las primeras técnicas ampliamente usadas están la cromatografía líquida de alta resolución de DNA (DHPLC, sigla del inglés) y la secuenciación por Sanger de los fragmentos de PCR, las cuales se basan en la amplificación de las zonas codificantes del gen y su posterior análisis para la detección de variantes. Otra técnica usada es la amplificación múltiple dependiente de ligación (MLPA, sigla del inglés), la cual ha mostrado una gran utilidad para la detección de grandes deleciones y duplicaciones de exones. El análisis de
cDNA (obtenido a partir del mRNA de la célula) es usado para detectar las
posibles omisiones o incorporaciones de determinados fragmentos en la secuencia del mRNA y así identificar mutaciones que afectan el splicing del
mRNA.
Entre las nuevas técnicas de secuenciación de ADN que se han desarrollado en los últimos años destacan las técnicas de nueva generación, que se suelen conocer como secuenciación de nueva generación (NGS, sigla del inglés) e incluyen diferentes tecnologías de alto rendimiento a gran escala y de manera paralelizadas (secuenciación del exoma completo, del genoma, del transcriptoma).
A diferencia de los sistemas de secuenciación tradicionales, estas plataformas son capaces de generar paralelamente, y de forma masiva, millones de fragmentos de DNA en un único proceso de secuenciación a menor tiempo y por coste cada vez más reducido. En este último aspecto, se pasó de forma exponencial de secuenciar unos cuantos millones de pares de bases (registrados en 1995) a los casi 30.000 millones (registrados en 2002), y el coste de cada nucleótido de secuencia publicada pasó desde 10 dólares en 1990 hasta unos 0.01 dólares en 2005 (Pettersson et al., 2009; Schuster, 2008).
71 Debido a su gran rendimiento, este tipo de plataformas ha sido rápidamente incorporado para el de estudio a gran escala de enfermedades monogénicas y genéticamente heterogéneas, difíciles de abordar con otro tipo de tecnología existente hasta la fecha debido al enorme coste que ello supone.
La existencia de bases de datos internacionales de mutaciones o de variantes de significado incierto permite verificar si una variante ha sido identificada anteriormente y la podremos clasificar como SNP (del inglés, polimorfismo de un solo nucleótido) o mutación. Si se trata de una variante frecuente en la población, queda descartado un efecto patogénico de dicho cambio. Por el contrario, si es una mutación ha sido encontrada ya en otros pacientes, nos confirma el carácter patogénico. En caso de no estar registrado en ninguna base de datos disponible, se hace necesario un análisis de dicha variante para confirmar o no su carácter patogénico. En este caso son muy útiles los análisis in silico, de predicción del efecto del cambio de aminoácido en la proteína. Estos modelos, tienen en cuenta la diferencia en las propiedades fiscoquímicas de los aminoácidos, la conservación de la posición en las secuencias de genes homólogos de distintas especies, la presencia de dominios funcionales en la región o el efecto esperado de cambio de la estructura terciaria de la proteína (Rudd et al., 2005). No obstante, en caso de duda el carácter patogénico de las mutaciones de cambio de sentido (missense) puede ser confirmado mediante un análisis funcional. El análisis funcional consiste en la transfección de células deficientes en el gen que se quiere analizar con un vector de expresión que contiene el mismo gen con el cambio a ensayar (introducido normalmente mediante un sistema de mutagénesis dirigida) (Lo Ten Foe et al., 1996). Posteriormente, con las células transfectadas se consiguen confirmar si se corrige el fenotipo celular, por ejemplo en AF, la sensibilidad a MMC. La existencia de corrección indica que el cambio no compromete la funcionalidad de la proteína y por tanto, no es patogénico.
En el caso de los resultados generados por la tecnología de secuenciación de alto rendimiento, surge la dificultad para el análisis de la gran cantidad de datos generados. Dicha dificultad implica el manejo de un volumen de datos bastante grande el cual requiere un manejo más sistematizado por plataformas bioinformáticas que faciliten la transformación de los datos brutos producidos en datos analizados de acuerdo a su impacto biológico. En este sentido
72 también se ha avanzado en el desarrollo de plataformas bioinformáticas que permiten la obtención de análisis fiables pero que requieren de personal altamente cualificado (D’Antonio et al., 2013; Davis et al., 2013; Huang et al., 2013).
Aplicaciones del análisis mutacional
Los investigadores han descubierto hasta el momento 16 genes AF [FANCA,-
B,-C,-D1 (también conocido como BRCA2), -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P y -Q]. Las mutaciones en estos genes representan más del 95% de los
casos reportados de AF. Las mutaciones en FANCA, FANCC y FANCG son los más comunes y representan aproximadamente el 85% de los pacientes con AF en todo el mundo. FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF y FANCL representan el 10%, mientras que los genes de AF restantes, FANCB, FANCI, FANCJ,
FANCM, FANCN, FANCO, FANCP y FANCQ representan menos del 5%.
Algunos individuos con AF no parecen tener mutaciones en estos 16 genes, por lo cual nuevos genes AF serán descubiertos en los próximos años.
A parte de representar la confirmación del subtipo genético, la identificación de las mutaciones es relevante en muchos sentidos. Desde un punto de vista clínico, permite realizar un cribado de portadores en familiares (fundamental en familias altamente consanguíneas), realizar el diagnóstico prenatal en embarazos tempranos, descartar la enfermedad en donantes de medula ósea emparentados y la selección de embriones sanos y HLA compatibles por diagnóstico preimplantacional. Adicionalmente, en un futuro cuando la terapia génica se haya podido desarrollo en AF será necesario tener la caracterización mutacional de la población AF para su tratamiento de corrección génica.
Por otra parte, como ya se comentó anteriormente, en algunas ocasiones el tipo de mutación explica parte del fenotipo observado en los pacientes. Tal es el caso de la mutación c.456+4A>T (IVS4+4A>T) o mutaciones en el exón 14 para el gen FANCC, analizados en la etnia Judía Ashkenazi, que fue asociada con una mayor severidad clínica, mientras que la mutación c.67delG en el exón 1 se asoció a una fenotipo más leve (Gillio et al., 1997). Sin embargo, en el gen FANCA no han reportado hasta el momento correlación alguna entre mutaciones y fenotipo, aunque en un estudio realizado en la cohorte europea
73 se observó asociación entre mutaciones bialélicas truncadoras y una edad de aparición de fallo medular más temprana y supervivencia reducida (Castella et al., 2011a; Faivre et al., 2000). En otros genes AF, como el FANCD1, FANCJ y
FANCN, el cribado de mutaciones en busca de portadores en la población
general tiene interés a nivel de salud pública ya que son genes de susceptibilidad al cáncer de mama y ovario, así como de otros tipos de cáncer familiar (Cantor & Guillemette, 2011; Begg CB et al., 2008; Garcia-Higuera et al., 2001; Reid et al., 2007). En este aspecto la identificación de mutaciones en estos genes se deben complementar con un consejo genético de los miembros de las familias portadoras.
1.6. MOSAICISMO POR REVERSIÓN SOMÁTICA EN LOS PACIENTES AF