97 27 casH anD casH equivalents (cont’d)
40,868,227 30,883,933 34,367,365 Other payables
El protocolo de cuantificación y detección de ADN por MLPA se realiza utilizando las recomendaciones dadas por la empresa MRC-Holland-MLPA (http://www.MRC-Holland.com), siguiendo los siguientes pasos:
140 Desnaturalización del DNA e Hibridación de las sondas
Se toma un volumen de 5 µL de cada una de las muestras de ADN (cuya concentración es de 20-30 ng/µL) y se colocan en los tubos utilizados para el correspondiente termociclador. Se calientan durante 5 minutos a 98°C, y se enfrían a 25°C.
Luego se adiciona 1,5 µL de “SALSA Probe-mix” + 1,5 µL de “buffer” de MLPA a cada muestra, y se mezcla cuidadosamente por pipeteo repetido. Se calientan por 1 minuto a 95°C, y luego se dejan en incubación a 60°C por 16 horas.
Reacción de ligación
Se reduce la temperatura del termociclador a 54°C y manteniendo esta temperatura se añade 32 µL de “Mix Ligasa-65”* a cada muestra y se mezcla cuidadosamente por pipeteo cada muestra. Posteriormente, se dejan las muestras en incubación a 54°C por 15 minutos, y seguidamente se calientan a 98°C por 5 minutos. Para inactivar la enzima de ligación, se pausa el termiciclador a 20ºC. En este punto las muestras pueden removersen del termociclador para preparar la reacción de PCR.
*“Mix Ligasa-65”: Se mezcla 3 µL de “Ligasa-65 buffer A” + 3 µL “Ligase-65 buffer B” + 25 µL dH2O y finalmente, se adiciona 1 µL “Ligase-65”. Se mezcla todo cuidadosamente, por pipeteo repetido.
Reacción de PCR
A temperatura ambiente, se adiciona 10 µL de la “Mix de polimerasa”* a cada muestra de ligación.
*“Mix de polimerasa”: se mezcla 2 µL “SALSA PCR primer mix” + 7,5 µL dH2O
+ 0.5 µL SALSA Polimerasa, y se mezcla bien por pipeteo, sin utilizar nunca el vortex. A continuación de colocan las muestras en el termociclador y se continua el programa de PCR. Las condiciones de la PCR que se utilizan son: 35 ciclos: 30 segundos a 95°C; 30 segundos a 60°C; 60 segundos a 72°C. Se termina con 20 minutos de extensión a 72°C.
Los “Primers” de PCR utilizados son:
“primer Forward” (marcado): 5'-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3´
“primer Reverse” (sin marcar): 5'-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3´ En la figura 54 se esquematiza todo el proceso de la MLPA.
141
Figura 54. Proceso de la MLPA. (A) Componentes de las sondas de hibridación de la MPLA.
Cada sonda se compone de dos secuencias de hibridación. (B) Para la hibridación de las
sondas se requiere previa desnaturalización de las cadenas de DNA. (C) Para la ligación de las
dos secuencias de la sonda se requiere la correcta hibridación de las misma a la cadena de DNA y el uso de una ligasa termoestable. (D) La amplificación se realiza con un mismo par de
cebadores y solamente se amplificaron las sondas correctamente hibridadas y ligadas. Cabe destacar que la secuencia de relleno le confiere a cada sonda una longitud de amplificación específica.
Comprobación de la amplificación por electroforesis en gel de agarosa
Posterior a la amplificación del producto de ligación de MLPA por PCR, se procede a realizar una comprobación del correcto amplificado de dicho MLPA utilizando un gel de agarasa al 2,5%, usando como colorante del ADN el
“SYBR safe” y como marcador de peso molecular un “Ladder” de 100pb.
En el corrido electroforético se espera observar un corrido homogéneo y difuso de ADN (en pincelada), y ubicado entre las bandas de 100 a 400pb. En la figura 55 se muestra un ejemplo de un corrido electroforético de los productos
142 de MLPA. La muestra de carga para el corrido electroforético se prepara con 4 µL de cada muestra de ADN de la MLPA y 1 µL de tapón de carga 5X, para un volumen final de 5 µL.
Figura 55. Comprobación por electroforesis en gel de agarosa al 2.5% del producto amplificado
de MLPA. La letra a representa las muestras que contienen la sonda P031, y la letra b
representa las muestras que contienen las sonda P032. 5a y 5b corresponden a las muestras de dH2O.
Electroforesis capilar del producto de MLPA amplificado
El análisis por electroforesis capilar se realizó en el servicio de genética molecular del departamento de Veterinaria de la UAB, el cual dispone de secuenciadores automáticos ABIPRISM 3730 de 48 capilares y ABIPRISM 3100 Avant de 4 capilares. Por lo tanto el software de análisis de fragmentos utilizado es el del sistema de Applied Biosystems sequencers GeneScanTM y el
marcador de peso molecular usado es el 500ROXTM.
La solución master de inyección es: 0.7 µL de PCR de MLPA + 0.3 µL de ROX + 9 µL de formamida. Posteriormente se escogen el juego de filtros compatibles con el colorante fluorescente usado. Para capilares de 36 cm se coloca inicialmente un voltaje de inyección de 1.6 kV con un tiempo de inyección de 15 segundos. Para el polímero POP4 se continúa con un voltaje de corrido de 15 kV y un tiempo de corrido de 1800 segundos. Para el polímero POP6 se usa un voltaje de corrido de 10 kV con un mayor tiempo de corrido. Finalmente para sellar la placa de inyección se incuba por 2 minutos a 80ºC y se enfría rápidamente.
Análisis de picos del corrido capilar por el Peak Scanner Software
Antes de calcular el ratio de los datos, es esencial evaluar primero la calidad del experimento de la MLPA. Por lo tanto, primero se inspeccionan los datos en
143 crudo, seguidos por la evaluación de los datos con el tamaño ya asignado, siguiendo las recomendaciones indicadas en el protocolo de MLPA 2012 colgado en la página de la casa comercial MRC-HOLLAND.
El análisis se puede realizar diferentes programas, entre los que están el “Peak
Scanner Software” o el Genotyper software o el coffalyser software, en este
trabajo los datos fueron analizados el Peak Scanner Software.
En la MLPA la normalización de los datos se hace en un proceso de dos pasos. El primero se basa en la determinación de la intensidad fluorescente relativa de cada pico dentro de cada muestra (intranormalización). En el segundo paso, el pico relativo es comparado con otras muestras (internormalización). En este último aspecto, el ratio final para una sonda determinada en una muestra del ensayo se compara con las muestras de referencia para misma sonda. Este ratio final obtenido se denomina cociente de dosis (Dosage Quotient, DQ). Para tener una fiabilidad aceptable de los análisis los resultados del cociente de dosis (DQ) deben cumplir los siguientes criterios:
La desviación estándar de todas las muestras de referencia procesadas con las diferentes sondas deben ser de < 0.1.
El DQ de las muestras de referencia procesadas deben estar entre 0.8 y 1.2.
Por otra parte, para el análisis de un número limitado de muestras puede utilizarse la evaluación visual del perfil de picos obtenidos con la electroforesis capilar. Para ello, se configura en la ventana correspondiente del programa que se esté utilizando para que aparezcan dos colores sobrepuestos y se renombra la muestra y el control. Finalmente se hace la comparación tomando como referencia la muestra control y se busca si hay alguna diferencia entre las dos muestras. Sin embargo, el análisis de nuestras muestras lo hemos venido realizando de acuerdo a una adaptación de este protocolo hecho en nuestro servicio del laboratorio en el momento en que se puso a punto esta técnica. Debido a la variabilidad que se observó en cada muestra control para cada experimento de MLPA que se realizaba, que influía en la interpretación de los resultados, se hizo necesario introducir por cada experimento 3 muestras de DNA de individuos sanos. A partir del pico promedio de estas muestras control se ha logrado disminuir esta variabilidad y hacer más reproducibles los
144 resultados. Por lo cual, las muestras de los pacientes en estudio son analizadas en nuestro servicio utilizando el ratio de tres controles en un mismo experimento. Ello hace necesario exportar todos datos a archivos Excel. Luego de exportar los datos al Excel, se pueden normalizar tanto los valores de los picos, como de las áreas, obtenidas de su procesamiento en el Peak Scanner
Software, tanto de las muestras de los pacientes como de los controles
utilizados. Finalmente utilizando el cociente que resulta del ratio la muestra de cada paciente por el ratio del promedio de los controles se elaboran las gráficas en el mismo Excel. El análisis de las gráficas se realiza para una misma muestra revisando cuidadosamente tanto los picos como las áreas obtenidos por ambas sondas (P031 y P032) para las mismas muestras, de acuerdo a los índices de la tabla 13.
Estado del número de copias (Copy number status)
Coeficiente de dosis (Dosage Quotient, DQ) Normal 0.85 < DQ < 1.15 Duplicación heterocigota 1.35 < DQ <1.55 Duplicación homocigota 1.70 < DQ < 2.20 Deleción heterocigota 0.35 < DQ < 0.65 Deleción homocigota 0
Número de copia equívoca Otros valores
Tabla 13. Los valores de los cocientes de dosis (DQ) de las sondas se pueden usar como un
índice para identificar un número anormal de copias en una muestra de ADN utilizando el ensayo de la MLPA.
Las gráficas de la figura 56 de dos pacientes AF españoles, han sido interpretadas teniendo en cuenta la tabla 13.
Como se puede apreciar en la figura 56, el kit P031/P032 FANCA de MLPA está diseñado para detectar la deleción de uno a más de los 43 exones que conforman el gen FANCA, lo cual permite discernir fácilmente la región que compromete la deleción.
145 Figura 56. Análisis de grandes deleciones en el gen FANCA por MLPA. (A) Determinación
de una deleción en homocigosis de los exones 4 al 6. (B) Determinación de una deleción en
heterocigosis de los exones 20 al 29.
A
146 3.2.4.2. PCR/Secuenciación para la detección de mutaciones en el gen
FANCA
Para realizar un análisis adecuado de la secuencia genómica del gen FANCA, se han tomado cebadores publicados en algunos artículos científicos, y se ha probado su especificidad para amplificar cada una de las regiones de los 43 exones de este gen. En algunos casos se han diseñado y puesto a punto otros cebadores específicos para algunas de estas regiones, debido a problemas con los cebadores que se habían tomado como referencia. Por lo tanto, se han optimizado PCRs para que cumplan con dicha característica. Una vez realizadas las PCRs se procede a la comprobación por medio de electroforesis en soporte de agarosa, identificando y purificando la banda de ADN esperada con un kit específico de purificación de ADN (NucleoSpin Extract II kit,
Macherey-Nagel). Posteriormente, los productos de amplificación son
procesados por un sistema de secuenciación automática para ADN, utilizando el equipo ABI 3730XL de “Applied Biosystems”. El servicio de secuenciación se lleva a cabo por la compañia “Macrogen Europe Laboratory” en Amsterdam, Holanda.
Amplificación por PCR de los exones del gen FANCA:
Los cebadores han sido diseñados en regiones intrónicas flanqueantes a los exones, de tal manera que permite amplificar las regiones completas de cada exón del gen FANCA. Estas regiones incluyen zonas intrónicas (importantes por la presencia de mutaciones de splicing en este gen).
El producto de los fragmentos amplificados por estos cebadores oscila en un rango de 150 a 500pb, lo cual le da una mayor fiabilidad al resultado del proceso de secuenciación. En la tabla 14 se muestran los diferentes pares de cebadores diseñados para cada uno de los 43 exones del gen FANCA.
147
Exón “Forward” (5’- - 3’) “Reverse” (5’- - 3’) Tm Tamaño
1 - CAGCCAATAGGAAGGCAG - - ACCTACCCAGCAGCTCG - 60°C 156pb 2 - GATGGTGGGTTTCTCGCGG -* - GAACTCCCGGGCTCAGGCGAC -* td 356pb 3 - GAATTTTTTAAATGGAGTTT - - CATTTCTACTTAATTTAGCA - 58°C 218pb 4 - GTGAGCTGCTTGGATCATCA - - TACTCTCTGCTCCACAGTCA - 58°C 360pb 5 - ACCTGCCCGTTGTTACTTTTA -* - AGAACATTGCCTGGAACACTG -* td 221pb 6 - GCATTCATAAAGGACTCAG -* - AGCCAGAAATCAAACCCGTCTGA -* td 245pb 7 - GGGACATATGGCTCAACTCAATC -* - GAGACAGGCTGTTCTGCCTCGC -* 58°C 289pb 8 - CTGAAGTGGATGGTCTGTGCC -* - CCCGTAAATAGGTACAAACAGC -* 58°C 277pb 9 - GCAGTATCACACAAATTACAG -* - GCACAGTGAAACATACAGAGG-* 58°C 207pb 10 - GTAGAAGTCTTGATGGATGTG -* - CTGCTGAAGCTCTGGAAGTG -* 58°C 296pb 11 - GATTGGTGGGTTGCGTGCAAGGC -* - AGAATTCCTGGCATCTCCAGTC -* 58°C 275pb 12 - CCCACAACTTTTTGATCTCTG -* - CGTCCACGGCAGGCAGCATG -* td 221pb 13 - GAGCTGTCACAGCTCCATGTG -* - GTAGGGAAGGGCTTCACTGAG -* 58°C 389pb 14 - GGAATACTTGATCACCCAGC -* - GCTGACAGCAAGGTTGCTCAC -* td 338pb 15 - GCTTCACACTCTTCTCTCCA - - TTCTTAGCAGTTGCCTTGAC - 58°C 260pb 16 - CAGCACTGTGGATGTTGGAAG -* - GAAAACAAAGCAGTTTCTGCTGG -* 58°C 249pb 17 - CCATGCCCACTCCTCACACC -* - AAAAGAAACTGGACCTTTGCAT -* td 203pb 18 - CGCACAGCATGTGGGCCTTTACC -* - GCACACCCTGCAGGCTACAG -* 58°C 333pb 19-20 - GAAACACCGGTCACCGTCTGTG -* - AGATCCACGATTCTTCGCATTGTC -* 58°C 348pb 21 - TAAGCCATAGCTGACTTAATT - - GCACAAGTCCCAGAGTGGACAAG- 58°C 155pb 22 - GTTCACAGCTCTGTATTTGAC -* - CTACTGGACTACTAGGAAGAC -* td 332pb 23 - GCAGGATCCGTGGAATCGTAC -* - GAGAAGGCTCCATGCGTCTAATG -* td 326pb 24 - GCTGGCCGGCTTCCTTC -* - CGGAGACGAGCTCATGAGTC -* td 238pb 25 - GCAATGCAGAAGATGGGTTGTC -* - AAGTAGCAGCCTGGCCCTC -* 58°C 310pb 26 - GAGGGCCAGGCTGCTACTT - - GACAGATAAAATTCTGGAAGG - 58°C 434pb 27 - CAGGCCATCCAGTTCGGAATG -* - CCTTCCGGTCCGAAAGCTGC -* 58°C 274pb 28 - GTGTGGGCTGTTGATGGTCTGTT -* - CTGTTCTTGCCCGAGGAGCACA -* 58°C 353pb 29 - GGAACTCTCAGCTGCATTTC -* - CAATGAGGACAGAACACAC -* 58°C 214pb 30 - GTCCCGAGCCGCCAGTTC -* - GGGCACCAGCTAGGCCAG -* td 354pb 31 - CACCGCGCCTGGCAATAAATATC - - CACACTGTCAGCGAAGCACAGCCA - td 205pb 32 - CTTGCCCTGTCCACTGTGGAG -* - CTCACTACAAAGAACCTCTAGG -* 58°C 369pb 33 - GACACAGGCCAAGGCTCTG -* - GGCATTCCAGACACTGTTCC -* 58°C 399pb 34 - GGCCACGCCAAGCCTTAGCG -* - CAGGAAGCTGACAGGAGGATC -* td 220pb 35 - GATCCTCCTTGTCAGCTTCCTG -* - TTTCCCTGAGATGGTAACACC -* td 311pb 36 - GTCATGGCTGGGGCAGCGGAG -* - TCCCTGCTCACACGAGAGG -* 60°C 310pb 37 - GGTGACAGGTGGGAATAAGGAC -* - CTTGCTCCAAGCCACATATTTG -* td 347pb 38 - GGGAGATGATGCTGAGTTGG - - GTCTGGAAACCCTGACTTGG - 58°C 466pb 39 - TCCAGAGGCCCAGTATTACC -* - GGGCTCGTTCTTAACCATTTG -* 58°C 348pb 40 - CCAGCCTGCTGACAGGTACC -* -GGACCCAGAGGTGCTGAGATG -* td 313pb 41 - CCCCATCTCAGCACTTCTGG -* - CCATAGTCTGCATGCTGTGC -* 58°C 390pb 42 - GCACAGCATGCAGACTATGG -* - GTCGAGTTGTATTGCCAGCC -* 58°C 281pb 43 - GGCTGGCAATACAACTCGAC -* - GGCAGGTCCCGTCAGAAGAGAT -* td 217pb
Tabla 14. Cebadores para la amplificación específica de los diferentes exones del gen FANCA
148 se ejecuta bajo el programa de PCR Touchdown. *Cebadores diseñados por el grupo de
Christophe Mathew.
Para la optimización de las PCRs de los diferentes exones del gen FANCA, se utilizaros dos estrategias diferentes. Primero, se han agrupado los pares de cebadores en una de las cuatro rondas de análisis mutacional para este gen, estrategia de rondas sugerida en un trabajo previo llevado a cabo por este grupo de investigación. Segundo, se ha optimizado unas condiciones comunes que permitan a la vez obtener un fragmento de amplificación específico para para cada grupo de exones.
PCR para la amplificación de los 4 grupos de exones en el gen FANCA
Para la amplificación específica de estos exones, los volúmenes y concentraciones de los compuestos usados en la solución madre de cada PCR están en indicados en la tabla 15.
Volumen en µL Concentración Final
H2O 15,875
Tampón de Taq a 10X(sin Mg2+) 2,5 1X dNTPs 1,25 mM 2,5 0,125 mM MgCl2 25 mM 1,5 1,5 mM
“primer Forward” 20 µM 0,312 0,25 µM
“primer Reverse” 20 µM 0,312 0,25 µM Taq Polimerasa (5U/µL) 1 1 U DNA (100 a 300 ng/µL) 1
Volumen total 25 µL
Tabla 15. Preparación de la solución madre de la PCR: volúmenes y concentraciones de los
compuestos de la PCR.
Con el fin de obtener fragmentos de amplificación más específicos, las condiciones del programa de PCR utilizados en el termociclador han sido modificadas para cada una de los grupos de exones.
Para la primera ronda, que incluye los exones 13, 36 y 38, además de la MLPA las condiciones del programa de PCR utilizados en el termociclador han sido las siguientes:
Desnaturalización 94ºC x 5 minutos Fase de PCR 94ºC x 20 segundos 58-60ºC x 30 segundos
72ºC x 40 segundos 35 ciclos Fase de extensión 72ºC x 5 minutos
149 Para la segunda ronda, que incluyen los exones 1, 3, 7, 8, 10, 16, 18, 19, 26, 27, 28, 32, 39, 41 y 42, las condiciones del programa de PCR utilizados en el termociclador han sido las siguientes:
Desnaturalización 94ºC x 5 minutos Fase de PCR 94ºC x 20 segundos 58-60ºC x 30 segundos
72ºC x 40 segundos 35 ciclos Fase de extensión 72ºC x 5 minutos
Dejar a 4ºC ∞.
En esta ronda hay que tener en cuenta que la solución madre de la PCR debe modificarse para una concentración final de Magnesio de 4 mM y 3 mM en los exones 3 y 26, respectivamente.
Para la tercera ronda que incluyen los exones 4, 9, 11, 15, 21, 25, 29 y 33, las condiciones del programa de PCR utilizados en el termociclador han sido las siguientes: Desnaturalización 94ºC x 5 minutos Fase de PCR 94ºC x 20 segundos 58ºC x 30 segundos (0,5 ºC x ciclo) 72ºC x 40 segundos 16 ciclos 94ºC x 20 segundos 55ºC x 30 segundos 72ºC x 40 segundos 26 ciclos Fase de extensión 72ºC x 5 minutos
Dejar a 4ºC ∞.
Para la cuarta ronda que incluyen los exones 2, 5, 6, 12, 14, 17, 20, 22, 23, 24, 30, 31, 34, 35, 37, 40 y 43, las condiciones del programa de PCR utilizados en el termociclador han sido las siguientes:
Desnaturalización 94ºC x 5 minutos Fase de PCR 94ºC x 20 segundos 60ºC x 30 segundos (0,5 ºC x ciclo) 72ºC x 40 segundos 16 ciclos 94ºC x 20 segundos 55ºC x 30 segundos 72ºC x 40 segundos 26 ciclos Fase de extensión 72ºC x 5 minutos
150 Análisis de los datos de secuenciación
Finalmente el análisis de las secuencias del DNA se lleva a cabo por dos vías en paralelo: el método de alineamiento local y la interpretación de los cromatogramas de las secuencias.
Después de recibir los datos del servicio de secuenciación, se procede a analizarlos por medio de métodos de alineamiento. Primero se busca identificar si la secuencia amplificada no se ha alterado, y si lo está que tipo de variante presenta (mutación o polimorfismo). Por lo tanto, usando el método de alineamiento local, que permite la comparación de pequeños fragmentos de dos secuencias en toda su longitud, se realiza el análisis bajo el mejor alineamiento posible. Para este tipo de alineamientos nosotros hemos venido trabajando con el programa EMBOSS Matcher - Pairwise Sequence Alignment:
http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_matcher/nucleotide.html.
Finalmente los alineamientos son revisados usando la base de datos genética
ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) y UCSC Genome Browser
(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway).
En paralelo al análisis por alineamiento, se realiza el análisis visual de las secuencias del DNA. Este análisis es muy importante cuando se trata de identificar y caracterizar una mutación, ya que permite determinar en el caso de mutaciones de cambio de marco de lectura si se trata de una deleción o una inserción, así como permite identificar el número de nucleótidos implicados. Adicionalmente, en el caso de tratar de identificar una segunda mutación dentro de una ya existente, el análisis visual y la experiencia del personal encargado se hacen muy relevantes. Con respecto al análisis visual, nosotros hemos usado un software libre y de fácil manejo como es el caso del programa
Chromas Lite 2.01. Este programa permite tener una visualización de los
cromatogramas de las secuencias y de esta manera permite identificar y comparar los picos de las secuencias que estamos estudiando con el fin de darle la mejor interpretación.
151 3.2.4.3. Implementación de la secuenciación masiva del exoma para el
estudio de pacientes AF de difícil subtipaje
Entre las nuevas técnicas de secuenciación de alto rendimiento que se han desarrollado en los últimos años, destacan las técnicas de nueva generación (Next Generation Sequencing o NGS), ya que permiten la secuenciación de grandes fragmentos del DNA, (ver tabla 17). Con la puesta en el mercado de nuevos ultrasecuenciadores capaces de secuenciar paralelamente, y de forma masiva, millones de fragmentos de DNA en un único proceso en un menor tiempo y por un coste cada vez más reducido.
Una de estas técnicas es la secuenciación del exoma completo, la cual permite la captura, el enriquecimiento y la resecuenciación dirigida de todas las subsecuencias genómicas codificantes de proteínas. Para la implementación de esta tecnología ha sido contratado la empresa de Sistemas Genómicos S.L. (Valencia, España), los cuales han desarrollado la metodología del proceso sobre la plataforma del ultrasecuanciador SOLiD versión 4 de Applied
Biosystems y el sistema de enriquecimiento dirigido SureSelect para 38Mb. El
uso de este secuenciador está basado en la baja tasa de errores que presenta para la secuenciación a gran escala.
Su proceso técnico está dado por:
La construcción de librerías de fragmentos enriquecidos con SureSelect target
Enrichment Human All exon a partir del genoma humano. Para la obtención de
estas librerías se aplican los protocolos y recomendaciones proporcionados por
Applied Biosystems para la secuenciación en SOLiD v4. La calidad y cantidad
de las librerías se valora por análisis con Qubit y Agilent 2100 Bioanalyzer. Cada librería se somete a un proceso de PCR en emulsión para la amplificación clonal de los fragmentos, seguidos de un proceso de enriquecimiento y modificación química para permitir la carga en la cámara de reacción. Finalmente se obtienen unas microesfereas para la secuenciación. Para la realización de este proceso se siguen los protocolos y recomendaciones de la casa comercial Life Technologies para la secuenciación en SOLiD v4. La calidad y cantidad de las microesferas obtenidas son analizadas teniendo en cuenta los parámetros del análisis del protocolo de trabajo antes de ser secuenciados. Posteriormente se lleva a cabo las
152 reacciones para la obtención de secuencias de 50 nt +25 nt (Paired- end) en SOLiD v4. La calidad de los datos obtenidos se estima mediante los parámetros proporcionados por el software SETS (SOLiD Experimental
Tracking System).
Finalmente, por una serie de procedimientos bioinformáticos se analizan los datos a de la siguiente forma:
Primero se obtienen las secuencias brutas y los valores de calidad asociados. Las imágenes obtenidas en cada ciclo de ligación son escaneadas con el
software SOLiD Analysis Tools (SAT) (http://solidsoftwaretools.com) para la
generación de secuencias en códigos de colores y los valores de calidad generados para grupo de lectura, F3 o F5.
Segundo se hace la determinación de variantes de significado incierto (SNVs,
indels, variaciones estructurales). Esto se hace en tres fases. En la primera