Object Properties for Securing the Correct Content in Module 2 of the

La eficacia biológica relativa de los distintos mutantes y/o poblaciones de VFA, se determina mediante experimentos de competición en pases seriados entre el virus problema y un virus de referencia (Holland et al., 1991).

Se coinfectan células BHK-21 a una m.d.i. de 0,1 UFPs por célula (2-4 x 106 _células infectadas con un total de 4 x 105 _{UFPs en el primer pase) con mezclas del virus problema y el} virus de referencia en proporción 1:1 y en las condiciones descritas en el apartado 4.4.1 ó 4.4.2, dependiendo si la determinación de fitness se realiza en ausencia o presencia de agentes antivirales. Cuando el efecto citopático es completo, se recoge el sobrenadante de infección. Para evitar que la m.d.i. sea superior a 1, se diluye 10 veces y se infecta una nueva monocapa de células BHK-21. El proceso se repite un total de 4 infecciones sucesivas.

Las coinfecciones realizadas en presencia de 5000 µM R se recogen a las 36 h aún cuando el efecto citopático no sea completo. En este caso, no se realiza la dilución del sobrenadante entre los distintos pases.

La cuantificación de la proporción de los dos virus competidores en cada pase se realiza mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real (descrita en el apartado 4.9), utilizando distintas parejas de oligonucleótidos que permiten discriminar entre las secuencias en que difieren las 2 poblaciones presentes durante la coinfección. Las condiciones utilizadas para la amplificación garantizan una discriminación de al menos 30 veces del virus problema con respecto al competidor.

La representación del logaritmo de la proporción de los dos genomas que compiten frente al número de pases da el vector de eficacia biológica (Duarte et al., 1992, Escarmís et al., 1996, Escarmís et al., 1999, Holland et al., 1991). El antilogaritmo de la pendiente es el valor numérico de eficacia biológica de un virus con respecto a otro.

4.13.1 Determinación de la eficacia biológica relativa de las poblaciones virales R-

Ap35, R-Ap45 y R-Ap60 con respecto a MARLS

La cuantificación de la proporción de dos virus en competición se realiza mediante RT- PCR cuantitativa a tiempo real (como se describe en el apartado 4.9). La mutación G7497A está presente sólo en los genomas de VFA que han sido pasados en presencia de R (R-Ap35, R- Ap45 y R-Ap60) y corresponde a la sustitución de aminoácido M296I en 3D. Se utilizan los oligonucleótidos y condiciones de hibridación previamente descritos por la Dr. Macarena Sierra en nuestro laboratorio (Sierra et al., 2007) (Tabla 4.2).

La cuantificación de RNA con la mutación G7497A de cada uno de los pases de los distintas poblaciones virales se determina por extrapolación de los valores de fluorescencia obtenidos en una recta patrón realizada en paralelo con RNA extraído a partir de una infección en células BHK-21 con R-Ap35, como se describe en el apartado 4.5.1. Para la cuantificación de virus que mantuvieran la secuencia original (G7497) se procede de la misma forma a excepción de que la curva patrón se realiza a partir de RNA extraído de MARLS.

Tabla 4.2 Condiciones de la cuantificación a tiempo real de RNA de VFA R-Ap35, R-Ap45 y R-Ap60.

OLIGONUCLEÓTIDO POBLACIÓNa _SECUENCIAb _ORIENTACIÓNc _Tº d _POSICIÓN e

MK WT MARLS GGAACAGCCAG ATGGCAT A 72 7512 MK RES R-Ap35 R-Ap45 R-Ap60 GGAACAGCCAG ATGGTAT A 68 7512 3DR4 n.d. ACTCGCATTGTC GACGTTTT S n.r. 7141

a _{Indica la población viral que es reconocida específicamente por el oligonucleótido utilizado. “n.d.” indica que el} oligonucleótido no discrimina entre ninguna de las poblaciones presentes en la infección y que se utiliza como pareja para la reacción de amplificación.

b _{Se especifica la secuencia del oligonucleótido. En negrita se indica la posición de la mutación que permite} discriminar entre las poblaciones presentes en la infección.

c _{Orientación del oligonucleótido iniciador: S significa “sentido” (de polaridad positiva); A significa “antisentido” (de} polaridad de la cadena negativa de VFA).

d _{Temperatura de hibridación del oligonucleótido a la cual se obtiene una amplificación específica (al menos 30 veces} de diferencia) de la población indicada en a _{, con respecto a la población competidora. “n.r.” indica que se trata de un} oligonucleótido que no reconoce específicamente las poblaciones presentes en la infección y que se utiliza como pareja de la reacción de amplificación. La temperatura de hibridación durante la reacción de amplificación está

determinada siempre por los oligonucleótidos que discriminan entre las distintas poblaciones presentes durante la infección.

4.13.2 Determinación de la eficacia biológica relativa de poblaciones virales

mutantes derivadas de clones infecciosos

La cuantificación de la proporción de los 2 virus competidores en cada pase se realiza mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real como se ha descrito en el apartado anterior.

Para la determinación de la eficacia biológica relativa de pMT28-3D(P44S), pMT28- 3D(2M) y pMT28-3D(3M) con respecto a pMT28, se han diseñado oligonucleótidos capaces de discriminar entre el codón que codifica en pMT28 el aminoácido P44 en 3D (6739CCA6741) y el codón que codifica la sustitución P44S (6739ACG6741) en pMT28-3D(P44S), pMT28-3D(2M) y pMT28-3D(3M) (Tabla 4.3.1). La cuantificación de RNA con el codón que codifica la sustitución P44S de cada uno de los pases se determina como se ha indicado en el apartado 4.13.1, utilizando como recta patrón RNA purificado de una transcripción de pMT28-3D(P44S).

Tabla 4.3.1 Oligonucleótidos y condiciones para la cuantificación de RNA de pMT28, pMT28-3D(P44S), pMT28-3D(2M) y pMT28-3D(3M).

OLIGONUCLEÓTIDO POBLACIÓNa _SECUENCIAb _ORIENTACIÓNc _Tº d _POSICIÓN e

P44 pMT28 GCCTTGTCT AACAAGGAC CCA S 65 6720 S44 pMT28-2C(P44S) pMT28-3D(2M) pMT28-3D(3M) GCCTTGTCT AACAAGGAC AGC S 65 6720 Ncopol3 n.d. GTGTCTGGC TCCATAGCG TCGAGTC A n.r. 6953

Tabla 4.3.2 Oligonucleótidos y condiciones para la cuantificación de RNA de pMT28, y pMT28-3D(P169S), y de pMT28-3D(2M) y pMT28-3D(3M).

OLIGONUCLEÓTIDO POBLACIÓNa _SECUENCIAb _ORIENTACIÓNc _Tº d _POSICIÓN e

P169 pMT28 pMT28-3D(2M) CCTGAAGGACGAAATTCG CCCG S 63 7095 S169 pMT28-3D(P169S) pMT28-3D(3M) CCTGAAGGA CGAAATTCG CAGC S 63 7095 AV3 n.d. TTCATGGCA TCGCTGCAG TGG A n.r. 7370

Tabla 4.3.3 Oligonucleótidos y condiciones para la cuantificación de RNA de pMT28, pMT28-2C(I248T) y pMT28-3D(4M).

OLIGONUCLEÓTIDO POBLACIÓNa _SECUENCIAb _ORIENTACIÓNc _Tº d _POSICIÓN e

I248(-1) pMT28 ACAACAAAT TGGACATCA TC S 65 5069 T248(-1) pMT28-2C(I248T) pMT28-3D(4M) ACAACAAATTGGACATCA CC S 63 5069 2CD4 n.d. ACACAGATT TTTGGGAAG GT A n.r. 5326

a _{Indica la población que reconoce específicamente el oligonucleótido utilizado. “n.d.” indica que el oligonucleótido} no discrimina entre ninguna de las poblaciones presentes en la infección y que se utiliza como pareja para la reacción de amplificación.

b _{Se especifica la secuencia del oligonucleótido. En negrita se indica la posición de la mutación que permite} discriminar entre las poblaciones presentes en la infección.

c _{Orientación del oligonucleótido iniciador: S significa “sentido” (de la misma polaridad que el RNA genómico del} VFA); A significa “antisentido” (de la polaridad de la cadena negativa del VFA).

d _{Temperatura de hibridación del oligonucleótido a la cual se discrimina la secuencia de interés en al menos 30 veces} con respecto a la secuencia alternativa. “n.r.” indica que se trata de un oligonucleótido que no reconoce específicamente las poblaciones presentes en la infección y que se utiliza como pareja de la reacción de amplificación. La temperatura de hibridación durante la reacción de amplificación está determinada siempre por los oligonucleótidos que discriminan entre las distintas poblaciones presentes durante la infección.

Para la determinación de la eficacia relativa de pMT28-3D(P169S) con respecto a pMT28, se diseñan oligonucleótidos capaces de discriminar entre el codón que codifica P169 en la polimerasa 3D de pMT28 (7114CCG7116) y el codón que codifica S169 en pMT28-3D(P169S) (7114ACG7116), (Tabla 4.3.2). La cuantificación de RNA de estos virus se determina como se explica en el apartado 4.13.1, utilizando como recta patrón RNA de una transcripción de pMT28 y pMT28-3D(P169S).

Para la determinación de la eficacia biológica relativa de pMT28-3D(3M) respecto a pMT28-3D(2M) se utilizan los mismos oligonucleótidos descritos en el párrafo anterior, empleando las condiciones indicadas en la Tabla 4.3.2. Como recta patrón se utiliza RNA transcrito de pMT28 y pMT28-3D(3M).

La eficacia biológica relativa de pMT28-3D(M296I) con respecto a pMT28 se determina con los mismos oligonucléotidos descritos en el apartado 4.13.1 y las condiciones de cuantificación son las mismas que se muestran en la Tabla 4.2.

Para la determinación de la eficacia biológica relativa de pMT28-2C(I248T) y pMT28- 3D(4M) con respecto a pMT28, se diseñan oligonucleótidos capaces de discriminar entre las secuencias que difieren en la posición 5087 (Tabla 4.3.3). La cuantificación de RNA con la mutación U5087C de cada uno de los pases se determinó por extrapolación de los valores de fluorescencia obtenidos en una recta patrón realizada con RNA de pMT28-2C(I248T). Para la

cuantificación de virus que mantuvieran la secuencia original (U5087) se procede de la misma forma a excepción de que la curva patrón se realiza a partir de RNA de pMT28.