Objectives

Las bacterias del género Aeromonas son consideradas autóctonas del medio acuático y han sido aisladas de ríos, lagos, agua de mar, agua potable y aguas residuales tratadas y no tratadas. Además, Aeromonas se encuentra ampliamente distribuida en el ambiente, pudiendo recuperarse en animales, principalmente peces (sanos o enfermos), siendo capaces de producir grandes epidemias en piscifactorias y en consecuencia son responsables de producir grandes pérdidas económicas en acuicultura. Las especie considerada como la responsable principal de generar estas epidemias es A. salmonicida habiéndose diseñado numerosos métodos moleculares para su identificación entre los que se incluyen una PCR para la detección delos genesfstA(codifica para elreceptor de sideróforo férrico) y gyrB (codifica para la subunidad β de la ADN girasa). Sin embargo recientemente se han descrito otras especies como A. piscícola que son genéticamente muy semejantes a A. salmonicida ya otras especies cercanas a ésta como son A. bestiarum que podrían quizás interferir en la detección especifica de A. salmonicida basada en el gen fstA y que deberían reevaluarse utilizando las especies mencionadas como posibles interferentes.

Las Aeromonas también se encuentran asociadas a huevos de mosquitos y a diferentes tipos de alimentos (mariscos, pescados, vegetales y productos cárnicos) y cada vez son más aisladas desde muestras clínicas de origen humano, donde se las reconocen como patógeno emergentes, siendo capaces de afectar tanto a individuos inmunocompetentes como inmunocomprometidos, en los que produce infecciones intestinales y extraintestinales. Sin embargo faltan datos fiables sobre la importancia de las distintas especies utilizando métodos de identificación molecular y sobre las características epidemiológicas de los pacientes.

Actualmente el agua es un recurso costoso y cada vez más escaso, por esta razón se han desarrollado diferentes métodos de tratamiento de aguas residuales, que permiten su reutilización, generando la que se denomina agua regenerada o reciclada. Esta agua regenerada es destinada principalmente al riego de frutas y hortalizas. Además gran parte de las aguas residuales no tratadas son vertidas en ríos y estuarios, en los que muchas veces se cultivan de forma intensiva tanto peces como moluscos bivalvos. Existen varios estudios que han detectado altas concentraciones de Aeromonas tanto en

aguas residuales tratadas y no tratadas, y que consideran que esta es la posible vía de diseminación de estos microorganismos a diversos tipos de alimentos, como por ejemplo verduras, peces y mariscos, destinados al consumo humano. Debido a que algunos de estos son consumidos principalmente crudos o escasamente cocidos, la presencia de estas bacterias, potencialmente patógenas, podría tener impacto en la salud pública, lo que hace necesario la rápida y correcta detección e identificación de esta bacteria.

Es bien sabido que tanto la detección y aislamiento como la correcta identificación a nivel de especies son procesos complejos en el género Aeromonas. A pesar de que se han descrito una gran cantidad de medios de cultivos para la detección de Aeromonas, estos no se han ensayado comparativamente para determinar su especificidad en matrices complejas como el agua residual y los alimentos. Además, los métodos de identificación fenotípicos clásicos, así como la utilización de sistemas comerciales miniaturizados y/o semiautomáticos (API 20E, VITEK, BBL Crystal, MicroScan) identifican erróneamente tanto a nivel de género como a nivel de especie, lo que ha generado una continua confusión con el género Vibrio y la sobrevaloración de la especie A. hydrophila tanto en muestras clínicas como en ambientales.

Teniendo en cuenta todas estas problemáticas, se hace necesario no sólo evaluar diferentes medios de cultivo, sino también que condiciones (cultivo directo vs cultivo tras un enriquecido) son las óptimas no sólo para favorecer la detección de este microorganismo, sino que también para conocer la diversidad real de sus especies en las diferentes matrices analizadas. Las técnicas moleculares son más rápidas y fiables que los métodos fenotípicos y han sido empleadas en la identificación de las colonias obtenidas tras el cultivo a nivel de género, mediante la detección por PCR del gen que codifica la Glicerofosfolípido Colesterol Acetil Transferasa (GCAT) que es específico para Aeromonas. Sin embargo este método no se ha ensayado todavía para la detección directa de Aeromonas en las muestras de agua. Este método es mucho más rápido que el cultivo y podría tener una gran utilidad en Salud Publica para el análisis rápido de Aeromonas. Tal y como hemos indicado la identificación fenotípica de la especies que es la que se ha utilizado mayoritariamente en la literatura ha generado una gran confusión sobre la importancia relativa de las diferentes especies del género. En este sentido cabe destacar que la utilización de las secuencias de los genes housekeeping,

además de identificar correctamente las especies descritas en este género, permiten el reconocimiento de potenciales nuevas especies. Por esta razón, la secuenciación del gen rpoD, será la estrategia de identificación que se utilizará en la presente tesis.

La identificación de Aeromonas en muestras clínicas mediante la utilización de métodos fenotípicos ha tendido a desvirtuar la prevalencia de especies, sin embargo tal y como hemos indicado en la introducción, hoy en día gracias a la utilización de métodos moleculares sabemos que las especies predominantes corresponden a A. dhakensis, A. caviae, A. veronii and A. hydrophila. Por esta razón es importante aplicar estos métodos en la validación de nuevas tecnologías de identificación, como es el caso del MALDI-TOF introducido como método de rutina en los laboratorios clínicos en muchos hospitales, para la identificación de los microorganismos de crecimiento lento o aquellos que son difíciles de identificar usando los métodos clásicos, como es el caso de Aeromonas. Otro aspecto importante es el análisis de las características epidemiológicas de los pacientes afectados por Aeromonas ya que conocernas nos puede permitir establecer si existe alguna tendencia específica, en cuanto a la edad, sexo y las especies asociadas.

Con la finalidad de contribuir a solucionar los problemas mencionados, los objetivos generales de este trabajo son:

1) Evaluar distintos métodos de detección, recuperación e identificación de Aeromonas a partir de muestras de aguas regeneradas, peces, mariscos y muestras clínicas para determinar cuáles pueden ser los más efectivos.

2) Estudiar la diversidad de especies de Aeromonas en aguas regeneradas, mariscos y vegetales para determinar la posible presencia de especies patógenas y las posibles vías de transmisión.

3) Establecer la identidad y las características de las cepas de Aeromonas aisladas de peces (truchas enfermas y carpas congeladas), de un cetáceo enfermo, así como de las cepas aisladas de pacientes procedentes de diversos hospitales.

4) Determinar en base a un estudio polifásico si las cepas que aparentemente corresponden a potenciales líneas filogenéticas en base al gen rpoD son efectivamente nuevas especies de Aeromonas.