Las técnicas de tipado molecular son esenciales para determinar las relaciones epidemiológicas entre las cepas y permiten reconocer cuales son la fuentes de contagio en caso de brotes epidemiológicos. Estas técnicas también permiten reconocer si los aislados incluidos en la descripción de nuevas especies son o no idénticas o derivan del mismo clon (Stackebrandt y cols. 2002; Figueras y cols., 2006; 2011b). Se han descrito diferentes métodos dependiendo de si se utiliza el genoma completo, por ejemplo: PFGE, RAPD-PCR, AFLP, REP-PCR, BOX-PCR y ERIC-PCR o un grupo de genes, como es el caso del ribotipado y el MLST (Figueras y cols., 2009). En el género Aeromonas las técnicas más utilizadas han sido el AFLP (Huys y cols., 2002, 2003) y el ERIC-PCR. Esta última se corresponde a la empleada en esta investigación. Considerando esto, esta será la única técnica que presentaremos en detalle conjuntamente con el MLST, por tratarse de una técnica recientemente descrita para Aeromonas y las ventajas que representa,serán abordadas a continuación.
1.2.7.1. Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus basado en la PCR (ERIC- PCR)
Existen múltiples estudios en los que se han utilizado la técnicas de ERIC-PCR sola o en combinación con otras técnicas de tipado en Aeromonas (DavinRegli y cols., 1998; Huys y cols., 2002; Sechi y cols., 2002; Huys y cols., 2003; Soler y cols., 2003a; Szczuka y Kaznowski, 2004; Aguilera-Arreola y cols., 2005; Figueras y cols., 2006; Beaz-Hidalgo y
cols., 2008a; Nocáková y cols., 2009; Maiti y cols., 2009; Fontes y cols., 2010; Figueras y cols., 2011d).
El ERIC-PCR fue aplicada en un estudio de cepas de A. hydrophila aisladas de 4 pacientes durante un mismo periodo y del agua de suministro del hospital. Aunque no se pudo demostrar la relación entre las cepas aisladas del agua y las de los pacientes, sí se encontraron 2 pacientes colonizados por la misma cepa que habían utilizado la misma habitación, demostrándose la eficacia de esta técnica en estudios epidemiológicos (DavinRegli y cols., 1998).
El estudio comparativo de Soler y cols. (2003a) en 26 aislados de A. popoffii de diferentes orígenes geográficos mostró que el ERIC-PCR era más discriminatorio que el REP-PCR, el RFLP, o el RFLP del ITS 16S-23S mientras que al combinar estas técnicas los mejores resultados se obtenían de la combinación del ERIC-PCR con el REP-PCR. Todas las técnicas tendían a agrupar las cepas en función de su origen geográfico (Soler y cols., 2003a). En los estudios de Huys y cols. (2002, 2003) se observa una buena correlación entre el ERIC-PCR y el FAFLP. Szczuka y Kaznowski en el 2004 tiparon mediante ERIC-PCR, REP-PCR y RAPD-PCR 120 cepas de Aeromonas de origen clínico y ambiental observando que ERIC-PCR y RAPD eran las más discriminatorias ya que con el REP-PCR, 25 cepas no se pudieron diferenciar. En este estudio, los autores no pudieron asignar un genotipo determinado de Aeromonas a cepas implicadas en gastroenteritis. Resultados congruentes entre ERIC-PCR y RAPD se observaron también en el estudio de Aguilera-Arreola y cols. en el 2005, en el que evalúan el genotipo de cepas de A. hydrophila. En este estudio se pudieron observar agrupaciones diferentes entre las cepas de A. hydrophila de origen clínico y las ambientales. En el estudio realizado por Figueras y cols. (2006) el ERIC-PCR produjo los mismos resultados que el PFGE y el AFLP. Maiti y cols. en 2009, al tipificar 42 aislados de origen clínico y ambiental no encontraron diferentes agrupaciones entre los genotipos. Estudios publicados en el año 2008 muestran que el ERIC-PCR podría ser útil para el tipado a nivel de especie (Nováková y cols., 2009) y subespecie (Beaz-- Hidalgo y cols., 2008a). En el estudio realizado por Fontes y cols. (2010) se analizaron los ERICs de cepas de Aeromonas aisladas tanto de carne como de heces de cerdo, así como del suelo del matadero en donde permanecían estos animales y se demostró que cepas de A. hydrophila recuperadas del diafragma y las heces de un mismo animal
presentaron idénticos patrones de ERIC-PCR, al igual que las cepas de A. caviae aisladas desde heces de cerdo y del suelo del matadero. Por otra parte, Figueras y cols. (2012d) encontraron que 23 aislados identificados como A. aquariorum, ahora A. dhakensis, de distintos orígenes pertenecían a 11 genotipos diferentes en base a sus patrones de ERIC-PCR (47,8% variabilidad genética) y se demostró la efectividad del este método para reconocer cepas redundantes así como para determinar la variabilidad genética intraespecífica.
1.2.7.2. Multilocus Sequence Typing (MLST)
El MLST fue propuesto como un método de identificación de relaciones clonales entre bacterias, basado en secuencias de genes housekeeping, en el año 1998 por Maiden.
EL MLST utiliza la secuencia de fragmentos internos de múltiples genes housekeeping (450-500 pb de siete genes) y para cada gen las secuencias procedentes de diferentes cepas son comparadas y a cada secuencia única se le asigna un número específico para cada gen o alelo (en este caso 7 alelos). Las cepas que muestras un mismo perfil alélico (secuencia idéntica de todos los genes) corresponden a una misma secuencia tipo (ST) la que es identificada mediante un número específico (Maiden y cols., 1998; Maiden, 2006; Figueras y cols., 2011b; Jolley y Maiden, 2014). Aunque un ST representa un pequeño porcentaje de la parte conservada de un genoma, mientras más perfiles alélicos y por lo tanto, más ST estén disponibles para cada bacteria, más fácil será comprender la estructura de las diversas poblaciones biológicas, mediante la identificación de cepas y complejos clonales (Maiden y cols., 1998; Maiden, 2006; Figueras y Beaz-Hidalgo, 2015; Jolley y Maiden, 2014).
Dentro de las ventajas que presenta este método destaca el que es universal (es aplicable a todas las bacterias) y que genera datos de forma dinámica, o sea, que son intercambiables, comparables y fácil de interpretar utilizando las bases de datos de acceso púbico creadas por Jolley y Maiden y actualizadas con nuevas prestaciones en 2010 (http://pubmlst.org/) a partir de los estudios realizados en distintos géneros y /o especies. Sin embargo no exite un esquema global y para cada género se requieren cebadores específicos para cada gen e incluso a veces para cada especie como ocurre en el MLST de Arcobacter (http://pubmlst.org/arcobacter/info/primers.shtml).Tal y
como explican Jolley y Maiden (2014) en la actualidad los principios del MLST se han aplicado al análisis de genomas completos aumentando el número de loci comparados hasta incluir todas la secuencias codificantes de un genoma (whole-genome MLST [wgMLST]). Esta aproximación también se ha denominado análisis genómico gen-a- gen (Sheppard y cols., 2012; Maiden y cols., 2013) y es la filosofía que ha motivado el diseño de la nueva plataforam Bacterial Isolate Genome Sequence Database (BIGSdb) que es la plataforma que en la actualidad gestiona la base de datos del MLST (Jolley y Maiden, 2010) y que también incluye una base de datos de genomas y que es gestionado a través de la web de la Universidad de Oxford, PubMLST ya mencionada (http://pubmlst.org/).
El esquema de MLST de libre acceso para Aeromonas fue creado en 2010 (http://pubmlst.org/aeromonas) en base a los datos obtenidos por Martino y cols. (2011) usando seis genes (gyrB, groL, gltA, metG, ppsA y recA) para caracterizar 100 cepas de Aeromonas (23 cepas tipo y de referencia más 77 cepas aisladas de peces, crustáceos y moluscos). En este estudio sólo 96 (3 cepas no amplificaron el gen ppsA y una no amplificó el gen gyrB) de las 100 cepas fueron utilizadas para la construcción del MLST y se obtuvo un total de 89 ST, de los cuales 86 (96,6%) fueron reconocidos sólo una vez, lo que demuestra una gran diversidad dentro de este género. Además, de los 6 genes estudiados, el número de sitios polimórficos variaron desde 140 (29,3%) para el gen gyrB hasta 233 (43,3%) para el gen ppsA, mientras que para el concatenado de los seis genes (3.084 pb) se detectaron un total de 1.073 (34,7%) sitios polimórficos. En la actualidad esta base de datos contiene 1722 secuencias provenientes de 433 aislados que se corresponden con 377 ST.
Un segundo esquema utilizando 7 genes (dnaK, gltA, gyrB, radA, rpoB, tsf y zipA) fue utilizado por Roger y cols. (2012b) de los cuales dos (gyrB y gltA) eran comunes con el MLST de Martino y cols. (2011) para caracterizar 195 cepas de Aeromonas (incluidas 62 cepas tipo y de referencia) y de las cuales 115 (59%) eran de origen humano, 39 (20%) de origen animal y 41 (21%) de origen ambiental. Entre 195 cepas estudiadas, detectaron un total de 175 ST y de estos, 164 (93,7%) se detectaron tan sólo una vez. En relación a los sitios variables encontrados, estos variaron entre 98 (23%) para el gen rpoB y 380 (70,8%) para el gen zipA. Un inconveniente de este estudio, es que los ST no se encuentran disponibles en una base de datos como ocurre
con el MLST de Martino y cols. (2011).
En el año 2013, Martino y cols. aumentaron el tamaño de la muestra a 258 cepas de Aeromonas, que incluye 92 del estudio realizado en 2011. De las 258 secuencias utilizadas en este estudio, 188 provienen de cepas aisladas de alimentos (principalmente de origen marino y vegetales), 55 de cepas de origen fecal y 15 corresponden a cepas tipo y de referencia. En este estudio se obtuvo un total de 250 ST, lo que al igual que en el estudio anterior demuestra una gran variabilidad. Lo mismo ocurre con los sitios polimórficos, ya que el gen más conservado fue nuevamente elgyrB (33,9% de variabilidad), mientras que el más variable fue el ppsA (48,9% de variabilidad). Es destacable el hecho de que en base a la proximidad genética de los ST se identificaron 2 grupos de Aeromonas según su origen. El primer grupo formado por A. veronii, A. sobria, A. allosaccharophila y A. popoffii aisladas desde peces. El segundo grupo estuvo formado por el resto de las especies (A. hydrophila, A. caviae, A. dhakensis, A. media, A. salmonicida, A.bestiarum, A. piscicola, A. simiae, A. diversa, A. schubertii, A. molluscorum, A. taiwanensis, A. sanarellii, A. tecta, A. trota, A. eurenophila, A. encheleia) que fueron aisladas desde alimentos y heces, salvo A. jandaei, que sólo fue recuperada desde muestras humanas. Al realizar el MLPA con las secuencias de los seis genes se observó que la distribución de las cepas era consistente con la filogenia de Aeromonas. Sin embargo, dos cepas, la A. veronii CECT 4908 y la A. bestiarum CECT 5233, se unieron a grupos filogenéticos diferentes, siendo estos A. allosaccharophila y A. hydrophila respectivamente.
Recientemente, Hossain y cols. (2014b) utilizando la base de datos del MLST diseñada por Martino y cols. (2011) demostraron que la cepa de A. hydrophila ML09- 119, responsable de generar diversas epidemias en el pez gato en piscifactorías de Alabama en Estados Unidos desde el año 2009, estaba relacionada con otras cepas de A. hydrophila (cepas S04-690, ZC1, XS91-4-1) altamente virulentas. La cepa S04-690 fue recuperada desde el año 2004 en peces enfermos en Estados Unidos, la cepa ZC1 fue aislada de carpas (grass carp) enfermas en la provincia de Guangdong, China el año 2009 y la cepa XS91-4-1, de origen chino fue recuperada también de carpas enfermas (silver loweye carp) en 2001 durante un brote epidémico. Las cuatro cepas comparten el mismo perfil alélico, correspondiente al ST 251, demostrando el origen clonal de estos cuatro aislados (Hossain y cols., 2014b). Este descubrimiento soporta la hipótesis de
que las cepas virulentas recuperadas en Estados Unidos emergieron debido a la expansión clonal de cepas patogénicas procedentes de Asia introducidas con las carpas.