5.2 Optical and UV Data
5.2.1 Observations and Analysis
La determinación del efecto del insecticida “Regent SC” (Fipronil) sobre Trichoderma sp. nativo, se realizó analizando el porcentaje de germinación y el porcentaje de crecimiento de dicho hongo, en las diferentes concentraciones del insecticida; procesando los datos en base a la prueba de Análisis de Varianza Unidireccional (ANOVA), según el paquete estadístico SPSS v. 15.
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RESULTADOS
En la Figura 1. Se observa que a medida que aumentan las concentraciones del insecticida Fipronil, disminuye el porcentaje de germinación a 53.78% y 22.52% para 100 ppm y 250 ppm respectivamente.
En la fig.2. se presenta la observación microscópica a 40x de las conidias germinadas y no germionadas Trichoderma sp. nativo.
En la Figura 3. Se observa que a medida que aumentan las concentraciones del insecticida Fipronil, disminuye el porcentaje de crecimiento a 67.90% y 47.70% para 100 ppm y 250 ppm respectivamente.
En la fig.4. se observa que el crecimiento radial de Trichoderma sp. nativo en los tratamientos con 100 ppm y 250 ppm del insecticida disminuye con respecto a su crecimiento en el control.
En la Figura 5. Se observa el enfrentamiento del antagonista Trichoderma sp. nativo (los que si crecieron en medio envenenado para cada concentración de Fipronil) frente al patógeno Botrytis cinerea.
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Fig.1. Porcentaje de germinación de Trichoderma sp. nativo frente a diferentes concentraciones (ppm) de Fipronil a las 24 horas de incubación.
a, b, c: p<0.05 Si existe diferencia significativa, entre los tratamientos y el control. 0 20 40 60 80 100 0 ppm 100 ppm 250 ppm 100 53.78 22.52 P o rc ent a je de G er m ina ció n de T richo d erm a sp. na tiv o Concentración (ppm) de Fipronil % de germinación de conidios a b c
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Fig. 2. Observación microscópica de la germinación de conidios de Trichoderma sp. nativo a diferentes concentraciones de Fipronil, a las 24 horas de incubación: A. 0 ppm;
B. 100 ppm; C. 250 ppm.
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Fig.3. Porcentaje de crecimiento de Trichoderma sp. nativo frente a diferentes concentraciones (ppm) Fipronil en condiciones de laboratorio y 7 días de incubación.
a, b, c: p<0.05 Si existe diferencia significativa entre los tratamientos y el control. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 ppm 100 ppm 250 ppm 100 67.90 47.70 P o rc ent a je de Cre cim ient o de T richo derm a s p. na tiv o Concentración de Fipronil % de crecimiento de la colonia a b c
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Fig. 4. Crecimiento radial de Trichoderma sp. nativa frente a diferentes concentraciones del insecticida Fipronil, en condiciones de laboratorio y a los 7 días de incubación.Donde: A. 0 ppm; B. 100 ppm; C. 250 ppm.
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Figura 5. Tipos de Antagonismo, según Bell et al.,presentado por los cultivos de Trichoderma sp. nativo, que crecieron previamente en Fipronil, frente a Botrytis cinerea en medio mezclado con adyuvante.
A) AntagonismoTipo 1, en Agar Papa Dextrosa (PDA);
B) Antagonismo Tipo 3, en PDA mezclado con “Regent SC” (100 ppm);
C) AntagonismoTipo 3, en PDA mezclado con “Regent SC” (250 ppm).
A
B
C
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DISCUSIÓN
Para incorporar productos biológicos en el manejo de un cultivo, es imprescindible conocer la sensibilidad de los agentes biológicos a los agroquímicos que se emplearán en dicho manejo, con el fin de conservar su capacidad controladora y establecer medidas de uso eficiente. En este aspecto la respuesta de Trichoderma varía en dependencia de las combinaciones especie/cepa de microorganismos y productos fitosanitarios evaluados.13 Por ejemplo, Durán et al 28, observaron una marcada inhibición del crecimiento micelial de Trichoderma frente al fungicida Fludioxonil+metalaxil, a una dosis letal media inferior a la recomendada para campo.
Sin embargo, en pruebas in vitro los fungicidas oxicloruro de cobre, metalaxil y dimetomorf fueron compatibles con diferentes especies de Trichoderma, mientras zineb, mancozeb y tiram mostraron ligera toxicidad y benomil se comportó como tóxico17. También mostraron diferentes grados de incompatibilidad y compatibilidad el efecto de los herbicidas sobre aislamientos de Trichoderma; se observó que cuando se aplica Trichoderma al suelo en presencia de diclorán se afecta su viabilidad 29 y que los herbicidas fenoxaprop-p-etilo, 2,4D sal de amina y glifosato
inhibieron significativamente el crecimiento de dos cepas de T. asperellum .16 .No obstante, productos de este tipo como trifluralin y napropamida, bispiribac-sodio y simazina fueron considerados compatibles con diferentes especies de Trichoderma. 17,30 .
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La acción de los insecticidas sobre este agente de control biológico también es variable. Dimetoato fue compatible in vitro con Trichoderma sp. al igual que metamidofos, y FIPRONIL como se observa en este trabajo, que afectó negativamente la germinación , el crecimiento y la patogenicidad de Trichoderma sp.. Sin embargo, cipermetrin y cihalotrin inhibieron significativamente el crecimiento de T. asperellum. No obstante, ninguno afectó la esporulación por mm2, ni la germinación de conidios.17
Con respecto a la evaluación del insecticida Fipronil el porcentaje de germinación de los conidios de Trichoderma sp. nativo varió de acuerdo con las 2 dosis aplicadas, y se obtuvieron valores significativamente inferiores en comparación con el tratamiento control. En los resultados de germinación obtenidos, se puede apreciar que éste disminuye a medida que se incrementa la concentración del químico (Fig. 1y2); este efecto indirectamente proporcional se nota desde la concentración de 100 ppm, siendo aún mayor en la concentración de 250 ppm. Además, cabe mencionar que existen diferencias significativas entre el control y los tratamientos.
Pese a que los insecticidas presentan un menor efecto sobre los bioplaguicidas, en comparación con los fungicidas, posiblemente, debido a que los insecticidas pueden tener como sitio blanco los procesos propios de los insectos que no afectan directamente a los hongos, en contraste con los fungicidas que afectan directamente los procesos de su metabolismo; no ocurre tal efecto en la aplicación in vitro de Fipronil a Trichoderma sp. nativo.5
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El porcentaje de germinación de conidios para este antagonista fue del 53.78% y 22.52% (Fig. 1) para las concentraciones de 100 ppm y 250 ppm del insecticida “Regent” SC (P.A: Fipronil) respectivamente. Esto probablemente se deba a que cuando se inicia el proceso de germinación, la espora absorbe agua del medio ambiente previo a la germinación propiamente dicha, los conidios de Trichoderma sp. nativo deben absorber agua y nutrientes ocasionando el hinchamiento de este, lo que es conocido como hinchamiento hidrostático donde el conidio absorbe agua del medio externo, en este caso, del medio agar papa sacarosa empleado para la germinación33, lo que podría ocasionar que el insecticida que ha sido disuelto con el agar papa sacarosa, ingrese junto con el agua al conidio, afectando así su germinación.31,32 Además los constituyentes presentes en la membrana citoplasmática del conidio de Trichoderma sp. sufren alteraciones, cambiando las propiedades de la membrana plasmática como la permeabilidad y selectividad (los cuales son mecanismos de protección frente sustancias tóxicas), que puedan alterar su comportamiento y como consecuencia la transducción de las señales de iniciación de la germinación y el reconocimiento del sustrato.34 Esta variación de la germinación del hongo también podría deberse a que el agroquímico evaluado bloquearía las funciones metabólicas de la espora. Asimismo, dicho bloqueo metabólico también podría verse favorecido por la acumulación de iones sobre la superficie de la membrana celular.35
También se puede apreciar que realizando el análisis estadístico de HSD de Tukey se encuentra que las concentraciones del insecticida evaluado es estadísticamente diferente, eso quiere decir que este insecticida tiene mayor efecto conforme aumenta su concentración (ppm).
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Referente a las observaciones microscópicas realizadas después de las 24 horas de incubada, Trichoderma sp. nativo (Fig.2), mostró una disminución moderada en la germinación y conforme las concentraciones del insecticida iban en aumento, la germinación disminuía proporcionalmente. Esto indicaría que al haber sido alterado el proceso metabólico y la membrana celular fúngica por los agroquímicos, la conidia no sólo no sería capaz de absorber las cantidades necesarias de agua; sino también de nutrientes, puesto que su batería enzimática (celulasas, glucanasas, lipasas, proteasas y quitinasas) liberada al comienzo de la germinación de la espora podrían haberse visto dañada, además que pierde su capacidad de selección y captación de nutrientes36.
Con respecto al efecto de las diferentes concentraciones de este insecticida sobre el crecimiento de Trichoderma sp. nativo, según el análisis estadístico existe diferencia significativa entre las concentraciones evaluadas y su control esto quiere decir que los insecticidas evaluados tienen efecto inhibitorio sobre el crecimiento de Trichoderma sp. nativo, por lo que a la concentración de 100 ppm y 250 ppm, el porcentaje de crecimiento fue de 67.90% y 47.70% respectivamente, con respecto al control (Fig. 3 y 4). Ello implicaría que el agroquímico evaluado afectó de forma significativa los procesos que ocurren en la pared celular durante el desarrollo del hongo; así como, produjo cambios en la actividad metabólica a nivel vesicular 37.
En relación a su patogenicidad, se observa que el insecticida cuyo principio activo es el Fipronil afecta negativamente al crecimiento, esporulación y mecanismos de defensa y ataque de Trichoderma sp. frente al patógeno Botrytis cinerea (Fig. 5); el
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control presenta antagonismo de tipo uno y se califica como antagonismo de tipo tres según la escala de Bell et. al. a las concentraciones 100 ppm y 250 ppm del plaguicida evaluado con respecto al control, ya que Trichoderma sp. y el patógeno cubren aproximadamente la mitad de la superficie del medio de cultivo..38
La capacidad como antagonista de Trichoderma es altamente variable. Mihuta- Grimm y Rowe demostraron que de 255 aislamientos obtenidos de diferentes lugares, solo el 15 % fue efectivo en el control de Rhizoctonia, y que las cepas nativas de un lugar son más efectivas que las importadas. Esta capacidad depende de la especificidad de la cepa, de sus modos de acción y de la actividad química al que estuvo sometido; es decir pueden existir aislamientos que sean más eficientes para el control de un patógeno que de otro; por tal motivo, la especificidad debe ser evaluada. Tal como se evaluó este Trichoderma nativo aislado de medios envenenados contra Botrytis cinerea, se obtuvo que afecta significativamente las concentraciones en aumento a su capacidad antagónica. Entre estos mecanismos de acción anatgónica se encuentran: antibiosis, competencia (por espacio y nutrientes), micoparasitismo, desactivación de enzimas de los patógenos y otros.
Recientemente, Harman y Vinale et al., informaron nuevos mecanismos con los cuales Trichoderma ejerce su acción como antagonista y colonizador de las raíces, como son: Aceleración del desarrollo del sistema radícular, que posibilita la tolerancia al estrés por parte de la planta; Solubilización y absorción de nutrientes inorgánicos; Estimulación del crecimiento vegetal e Inducción de resistencia.12 Estos actúan indirectamente sobre los patógenos, ya que su acción es elicitar o impulsar
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mecanismos de defensa fisiológicos y bioquímicos en la planta. Es importante resaltar que la mayoría de estos procesos se efectúan en la rizósfera.13
Según los resultados obtenidos podemos decir que la concentraciones de Fipronil afectan negativamente la germinación, crecimiento y patogenicidad de Trichoderma sp. nativo aislado de la rizósfera del suelo agrícola de “repollo” en la provincia de Otuzco. Y debido a la variabilidad de resultados con respecto a otros trabajos, es necesario destacar que el presente trabajo es válido sólo en condiciones de laboratorio, ya que las concentraciones de “Regent” usadas son en base a las aplicaciones en campo que varían en un rango de 100 ppm a 250 ppm dependiendo del cultivo donde se aplique. Por lo tanto, se hace necesario posteriores trabajos en campo para verificar dichos resultados.
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CONCLUSIONES
Al incrementarse las concentraciones de Fipronil en el rango de 100 ppm a 250 ppm disminuye significativamente la germinación, en condiciones de laboratorio, de Trichoderma sp. nativo.
Al incrementarse las concentraciones de Fipronil en el rango de 100 ppm a 250 ppm disminuye significativamente el crecimiento, en condiciones de laboratorio, de Trichoderma sp. nativo.
Al incrementarse las concentraciones de Fipronil en el rango de 100 ppm a 250 ppm disminuye significativamente la capacidad antagónica en condiciones de laboratorio de Trichoderma sp. nativo frente a Botrytis cinerea.
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RECOMENDACIÓN
Cabe resaltar que los resultados encontrados en el laboratorio pueden diferir con los obtenidos en campo debido a la presencia de variables no manejables como la temperatura, humedad relativa, composición del suelo, pH, flora microbiana presente en campo.
En consecuencia es recomendable realizar estudios en campo para evaluar el efecto real que ejerce este insecticida sobre Trichoderma sp. nativo (aislado de la rizósfera de suelo agrícola de repollo en la ciudad de Otuzco). También evaluar a concentraciones menores de 100 ppm de Fipronil, tanto en laboratorio como en campo, para determinar en qué concentración no produce un efecto negativo sobre Trichoderma sp. nativo, para así poder programar una mejor aplicación de ambos controladores dentro de un plan de manejo integrado. Y evaluar la patogenicidad del antagonista nativo sobre otros hongos fitopatógenos.
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