El reactivo de Folin-Ciocalteu (RFC) contiene complejos de ácidosfosfomolíbdico/fosfotúngstico que reaccionan en medio básico, formando complejos azules que pueden ser detectados espectrofotométricamente a longitudes de onda entre 750 y 765 nm [87]. Generalmente, se emplea ácido gálico como compuesto estándar y los resultados se expresan en mg/L del ácido. Sin embargo, el reactivo de Folin-Ciocalteu no es específico para compuestos fenólicos, por lo que también puede reducir otra clase de compuestos, por ejemplo, aminas aromáticas, ácido ascórbico, Cu(I), Fe(II), entre otros [87].
Se han encontrado excelentes correlaciones entre los resultados obtenidos con el método Folin-Ciocalteu (FC) y algunos ensayos antioxidantes de transferencia de electrones, e.g., TEAC y DPPH [88]. Magalhaes y colaboradores [89] realizaron un estudio comparativo entre los resultados obtenidos con el ensayo de decoloración del catión-radical ABTS+• y el método de Folin-Ciocalteu de 72 bebidas como vino tinto, jugos, infusiones de plantas aromáticas y cervezas, y encontraron coeficientes de correlación mayores de 0.918. Algunos autores han determinado que aquellos compuestos antioxidantes, que no reaccionen mediante un mecanismo de transferencia de electrones, e.g., -caroteno, ácidos cinámico y cítrico, tampoco reaccionan con RFC [90].
Prior y colaboradores [19] encontraron un factor de correlación de 0.82 entre los resultados de contenido de fenoles, medidos por el método FC, y la capacidad antioxidante evaluada por el método ORAC, de bebidas y algunas
78 especies vegetales, a pesar de las diferencias en el mecanismo de reacción. El ensayo de FC es relativamente simple, reproducible, puede ser estandarizado y la absorción del producto de reacción ocurre a altas longitudes de onda (750-765 nm), lo cual minimiza las interferencias de la matriz [87]. Sin embargo, el tiempo de análisis largo (2 h) es una desventaja, porque dificultala implementación del método como análisis de rutina en el laboratorio. Además, pueden ocurrir reacciones secundarias de polimerización, con regeneración de los fenoles, ya oxidados, lo que causa error en la medición.
La oxidación de los compuestos fenólicos, cuando se emplea RFC, aumenta con la alcalinidad del medio y cuando los grupos hidroxilo de la molécula no se encuentran protonados [85]. Durante la reacción de oxidación, el ion fenolato puede ser regenerado por polimerización de los fenoles, ya oxidados, por lo que la reacción puede repetirse y el fenol regenerado suele ser oxidado más fácilmente que el inicial. Por esta razón, la reacción debe ocurrir a pH básico y debe alcanzar el punto final de medida lo más rápido posible [85].
En el método “clásico” se utiliza como base carbonato de sodio (pH≈11) y el tiempo final de reacción llega a 2 horas. Durante este tiempo, se puede promover la regeneración del ion fenolato, que causa una mayor coloración (azul) del medio. Además, cuando se usa carbonato de sodio (Na2CO3), se
producen burbujas de CO2, que generan interferencias y errores en las
mediciones. Con el fin de lograr una rápida reducción de RFC, varios autores [¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.] desarrollaron un método ápido, modificando la concentración de RFC y el tipo de base (NaOH (pH≈14)).
En el presente trabajo, se realizaron algunas pruebas preliminares modificando el tipo de base, con el fin de comprobar, que con el uso de NaOH, es posible disminuir el tiempo de reacción sin que la respuesta varie significativamente. Los valores de absorbancia obtenidos para el ácido gálico, a una concentración de 55 mg/L, fueron monitoreados a 750 nm durante 120 y 30 min, con el método “clásico” y el rápido, respectivamente. En la Figura 28, se observa que
79 con carbonato de sodio (A), la sensibilidad (%) incrementa a lo largo del tiempo de reacción hasta alcanzar un valor máximo entre los 100 y 120 min. Con hidróxido de sodio (B), la mayor sensibilidad se obtuvo a los 4 min, mientras que a los 30 min fue del 97%.
Figura 28. Sensibilidad relativa (%) de la curva del ácido gálico (n=24) en medios de reacción
con diferentes bases: A. Carbonato de sodio (Na2CO3) (3% (W/V)); B. Hidróxido de sodio
(NaOH) (0.175 M). La sensibilidad relativa (%) se estimó por la relación entre el valor de absorbancia en función del tiempo y el valor obtenido a los 120 min (Experimento A) y 4 min
(Experimento B).
Adicionalmente, el contenido de fenoles de una solución del ácido ferúlico (58 mg/L), se midió por ambos procedimientos. En los dos medios de reacción se encontraron pérfiles similares a los del ácido gálico en los dos medios de reacción. En la Figura 29, se presentan los resultados alcanzados con el uso de soluciones básicas de carbonato de sodio (A) e hidróxido de sodio (B). Se comprobó, que con carbonato de sodio (A), la sensibilidad (%) aumentó hasta alcanzar un equilibrio, entre los 100 y 120 min, y con hidróxido de sodio (B), a los 4 min de reacción, se logró la máxima de sensibilidad (%), que decae con el tiempo. 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 95.0 100.0 105.0 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0 Se n s ib il id a d r e la ti v a , % Tiempo, min.
A
B
80 Figura 29. Sensibilidad relativa (%) de la curva del ácido feúlico (n=24) en medios de reacción
con diferentes bases: A. Carbonato de sodio (Na2CO3) (3% (W/V)); B. Hidróxido de sodio
(NaOH) (0.175 M). La sensibilidad relativa (%) se estimó por la relación entre el valor de absorbancia en función del tiempo y el valor obtenido a los 120 min (Experimento A) y 4 min
(Experimento B).
Para fines comparativos se analizó el contenido de fenoles de los compuestos Trolox® y ácido ferúlico, su valor se presenta en la Tabla 7. Los resultados se expresan como la relación (%) ± la desviación estándar, entre las pendientes de las curvas de calibración de cada compuesto y la del ácido gálico (para todas las curvas de calibración el valor R2 fue mayor de 0.993, n=32). Se puede observar, que no existen diferencias, estadísticamente significativas, entre los valores obtenidos por los métodos “clásico” y el rápido, para los dos compuestos evaluados. Además, los resultados concuerdan con lo reportado por Magalhaes y colaboradores [90]. Sin embargo, para el Trolox® los valores obtenidos por los métodos “clásico” y el rápido difieren de los encontrados por Stratil y sus colaboradores [91]. Las diferencias en el contenido de fenoles de las sustancias reportadas en la Tabla 7 no resultaron estadísticamente significativas, por lo cual, se decidió validar el método rápido.
65,0 70,0 75,0 80,0 85,0 90,0 95,0 100,0 105,0 0,0 20,0 40,0 60,0 80,0 100,0 120,0 S en sibi li da d rel ati v a, % Tiempo, min A B
81 Tabla 7. Comparación del contenido total de fenoles del Trolox® y el ácido ferúlico, medidos por los métodos “clásico” y el rápido, con los reportados en la literatura (Relación (%) ± S) [90, 91].
Compuesto
fenólico Clásico Rápido [90] [91]
Trolox® 38.9 ± 0.3 39 ± 1 40 ± 1 33 Ácido ferúlico 82 ± 1 83 ± 1 82 ± 3 82
Para la validación del método, se determinaron las siguientes figuras analíticas de mérito, a saber: linealidad y sensibilidad, límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) y la precisión expresada como repetibilidad y reproducibilidad, ello, según lo recomendado por la AOAC Internacional [92].
5.2 FIGURAS ANALÍTICAS DE MÉRITO DEL MÉTODO