El estudio de REE con generación biológica de radicales libres se realizó en medio PBS (solución fosfato tampón de 0.01 M; 0.138 M de NaCl; 0.0027 M de KCl de pH 7.4), con NADPH 1,7 mM en buffer fosfato pH 7,4, se utilizó una concentración de microsomas de 2,4 mg/mL provenientes de la cepa Dm28c de T. cruzi en la fase epimastigote. El spin trap utilizado fue el DMPO en concentración de 500 mM en buffer fosfato pH 7,4. La concentración de la droga fue de 5 mM.
Se registró un control con microsomas en medio buffer fosfato pH 7,4, NADPH y DMPO con ausencia de nitrocompuesto, en el que se evidencia la no generación de especies radicalarias (Fig.28A) por parte del sistema microsomal.
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Se observó que todos los compuestos estudiados generaron un mismo patrón de acoplamiento hiperfino, luego de diez minutos de incubación con el compuesto. Las intensas señales que se aprecian son consistentes con el atrapamiento del radical metilo (sexteto de aH~23,0G, aN~15,4G) producto de la reacción del radical hidroxilo con el
solvente [24] (Fig.26).
Figura 26. Reacción de generación de radicales metilos, por reacción entre un radical hidroxilo en presencia
de DMSO (kOH/DMSO = 7x109 M-1s-1; kOH/DMPO = 3,4x109 M-1s-1), y posterior atrapamiento por el spin trap DMPO.
La intensidad con la que aparece el sexteto atribuible al aducto DMPO/CH3 (aH~23,0
G, aN~14,50 G), es proporcional a la generación del radical hidroxilo, lo cual es una
evidencia de la generación de este radical por acción exclusiva de los nitrocompuestos estudiados, posiblemente vía reciclaje redox [7].
Dado que el control no arrojó ninguna señal; esto indica que el DMPO no se descompone inmediatamente y que ningún radical libre estaba siendo atrapado por este
spin trap. Por otra parte, es posible observar el cuarteto (aH~aN~15,4 G) asignable al
aducto DMPO/OH, evidencia de que el radical hidroxilo se generó por la presencia del nitrocompuesto. Posteriormente, este aducto puede sufrir una doble oxidación (Fig.26), formándose así un compuesto paramagnético (DMPOX, 5,5-dimetil-2-oxo-pirrolin-1-oxil) [25,26], que es observable en el espectro como un triplete (aN~ 14,62 G).
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Figura 27. Atrapamiento del radical hidroxilo y generación del aducto DMPO/OH. Doble oxidación del aducto con
formación de un compuesto REE sensible, DMPOX.
Con esto, se ha demostrado un mecanismo de generación de ROS para todos los nitrocompuestos estudiados. En todos los espectros se observa el triplete del DMPOX con iguales intensidades, con lo cual se concluye que no hay una relación entre la producción de esta señal y la actividad antichagásica. Tampoco se aprecia diferencias de intensidad del sexteto asignable al aducto DMPO/CH3 entre los nitrocompuestos.
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Figura 28. Espectro experimental para los espín-aducto generados en microsomas de T.cruzi (cepa
Dm28c) a temperatura ambiente. (A) Control: Extractos en medio PBS, NADPH y DMPO. (B) Espectro registrado con incubación de la fracción microsomal, NADPH, compuesto VATR81 y DMPO, en medio buffer fosfato pH 7,4. Se ha marcado con el símbolo (+) el correspondiente patrón hiperfino para el espín-aducto DMPO/CH3. Con los signos (#) y (*) se denota las señales para los
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Ensayos de actividad biológica.
Para los ensayos de bioactividad, se midió además el IC50 de los nitrocompuestos
estudiados y de nifurtimox en todas las cepas celulares, como control positivo.
Se utilizaron cultivos celulares de macrófagos de la cepa RAW 264.7 para obtener los IC50 de los compuestos en un modelo celular mamífero. Cada experimento se realizó
en triplicado en las mismas condiciones experimentales.
Tabla 6. Valores de IC50 en células murinas de RAW 264.7 y en epimastigote de la línea Dm28c.
Índice de selectividad.
Compuesto IC50 Macrófagos IC50 Epimastigote Índice de
selectividad2 VATR71 >400 µM 177±3,11 µM - VATR72 >400 µM >400 µM - VATR73 35,31±6,30 µM >400 µM - VATR74 >300 µM >400 µM - VATR78 >300 µM Inactivo1 - VATR81 84,10±4,05 µM 9,03±0,55 µM 0,107±0,012 Nifurtimox 255,7±14,7 µM 27,80±2,07 µM 0,109±0,014 1
VATR78 precipita a partir de los 50 µM.
2
índice de selectividad = IC50 (epimastigote)/IC50 (macrófago)
De los resultados obtenidos se observa que sólo el compuesto VATR78 presenta un índice de selectividad comparable con el control positivo, nifurtimox; sin embargo, el rango de concentraciones es más estrecho. De los demás compuestos no se obtuvo el índice de selectividad pues el valor sería inexacto.
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Figura 29. Gráficos de barra de los IC50 en células murinas de RAW 264.7 y en
epimastigote de la línea Dm28c
Una vez realizados los ensayos a distintas concentraciones de droga (entre 5 y 200 µM), se construyeron graficas de dosis-respuesta. Se graficó el logaritmo de la concentración de droga versus el porcentajes de células viables, considerando al control como el 100% de células viables.
Es interesante destacar que los compuestos VATR73 y VATR74, que son los compuestos con mayores constantes de desproporción (Tabla 3) son además los compuestos menos activos biológicamente.
Figura 30. Curva dosis-respuesta para el compuesto VATR81 en células RAW 264.7.
VATR81 en células RAW 264.7
-10 -8 -6 -4 -2 0 50 100 150 Log[VATR81] % v ia b il id a d
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Conclusiones
o El estudio de electroquímico de los compuestos, en medio aprótico, indicó un proceso de reducción correspondiente a la generación del radical anión nitro y mostrando además, que en tales condiciones poseen una menor capacidad para reducirse que el control positivo nifurtimox.
o Se determinó que el mecanismo de reducción y generación de la especie radicalaria es dependiente del tipo de estructura del nitro-compuesto. Asignando un mecanismo ECE, o de autoprotonación, para aquellos nitrocompuestos con hidrógenos lábiles; y un mecanismo E, de transferencia electrónica pura, para aquellos compuestos sin hidrógenos lábiles. Además, los radicales formados fueron más estables que el control positivo, a excepción del compuesto VATR74, en las mismas condiciones experimentales.
o Ocupando la metodología de desactivación del radical DPPH, se observó que la labilidad del enlace N-H es mayor para el compuesto VATR81 (enlace de tipo iónico); y el compuesto VATR71 es mayor que VATR72 (enlace de tipo covalente).
o El efecto del ácido ascórbico en la generación del radical nitro fue similar con todos los compuestos. Se propuso un mecanismo en el cual el nitrocompuesto transfiere dos electrones al ácido ascórbico.
o No se constató una correlación entre la constante de desproporción y el potencial de reducción o la actividad biológica.
o Por medio de la REE se demostró que efectivamente se forma el radical, generado al potencial obtenido de la electroquímica.
o Las constantes de acoplamiento hiperfino fueron asignadas adecuadamente, mediante simulación teórica. Donde se observó que para el nitroindazol VATR81 se obtuvo un patrón de acoplamiento hiperfino que fue asignado a tres tripletes correspondientes al acoplamiento con núcleos de nitrógeno del
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grupo nitro, de N-1 y N-2, y tres dobletes asignados a los núcleos de hidrógenos H-4, H-6 y H-7; mientras que para el nitroindazol VATR78 se observa una menor interacción con el N-2 del anillo aromático, resultando en un patrón de 6 líneas. En el caso de las nitroquinazolinas VATR71-VATR74, se observó una menor interacción con el núcleo de N-3, obteniéndose dos tripletes asignables a los nitrógenos del grupo nitro y de N-1 y tres dobletes correspondientes a H-5, H-7 y H-8.
o Todos los compuestos estudiados fueron capaces de generar ROS en presencia de microsomas parasitarios. Pudiendo relacionar una vía de acción radicalaria como posible mecanismo tripanocida.
o De los resultados obtenidos se observa que sólo el compuesto VATR81 presenta un índice de selectividad comparable con el control positivo, nifurtimox; sin embargo, el rango de concentraciones es más estrecho.
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