GrowinG Up in Scotland: Birth cohort 2 Results from the first year
CHAPTER 5 Parenting support
5.4 parenting groups and classes
5.4.2 Parenting classes and programmes
BL21
DH5α
Verificación del Banco
Mini- prep
Digestión
EcoRI
IDShr
Escherichia coli
Plásmido
digerido
Cultivo medio LBA
Cultivo en
100 ml
Cultivo en
10 ml
Actividad
ELISA Indirecta
Western Blott
LISADOS CELULARES
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EVALUACIÓN DE DOS CLONES DE Escherichia coli TRANSFORMADOS MEDIANTE UN VECTOR PLASMÍDICOCON EL ADN COMPLEMENTARIO
DE LA IDURONATO 2- SULFATO SULFATASA HUMANA
Rojas Molano, Andrea
1; Córdoba Ruiz, Henry
2; Barrera Avellaneda, Luis
Alejandro
1
Microbiologia Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias.
2
Ingeniero Químico, Maestría Ing. Química. Profesor del Departamento de Química. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias.
3
Director Instituto de Errores Innatos del Metabolismo.
Resumen
La expresión de proteínas recombinantes, ha sido de gran utilidad en el empleo para la terapia de reemplazo enzimático. El síndrome de Hunter, enfermedad metabólica en la que la enzima Iduronato 2- sulfato sulfatasa ha perdido su funcionalidad y se encuentra deficiente. El Instituto de Errores Innatos del Metabolismo ha diseñado un nuevo modelo de expresión empleando procariotas para la expresión de proteínas. Por tanto, se desea expresar la IDSh en un modelo recombinante Escherichia coli transformado en la Universidad del Quindío, microorganismo ampliamente utilizado para expresar proteínas menos complejas. En el presente trabajo se pretende evaluar la transformación del plásmido pGEX3X/IDS en las cepas BL21 y DH5α, por medio de la técnica PCR, para cual se diseñaron los primers que permitan verificar la inserción completa del ADNc en el plásmido, y su correcta direccionalidad dentro del marco de lectura, evidenciando la pérdida de un fragmento de 1.5 kb. Además, se establecieron condiciones de ruptura celular, y con base en la lectura de proteínas totales de los lisados se logró estandarizar las condiciones de detección para Western blot y ELISA indirecta. Adicionalmente, se consideraron protocolos básicos para identificar la presencia del producto de interés como proteína insoluble en cuerpos de inclusión. Se propone esta metodología previa a estudios de producción y escalado de este producto recombinante.
Abstract
The expression of recombinant proteins in Eukariotic and procariotic organisms has been very useful in enzyme replacement therapies, including Hunter disease or Mucopolysaccharidosis II (MPS II). MPS II is caused by the deficiency of Iduronate 2- sulphate sulphatase (IDS). The Institute for the Study of Inborn Errors of Metabolism (IEIM) has develop a new expression model utilizing Escherichia coli expression of proteins such as IDS.The purpose of the study was to express IDS in the recombinant model of Escherichia coli transformed at University of Quindio. The aim of this work was to the transformation efficiency conditions for the plasmid pGEX3X/IDS in strains BL21 and DH5 α by means of PCR technique. The primers were designed to verify the complete insert of the cDNA in the plasmid, and their correct orientation within the reading frame. In addition, conditions for cellular rupture were standardized. Based on lysate total proteins it was possible to standardize the detection conditions for Western blot and indirect ELISA. Moreover, basic protocols were used in order to identify IDS as insoluble proteins in inclusion bodies. We propose this methodology to evaluate the efficacy of the insertion steps, before the scaling up process for the enzyme production.
1. INTRODUCCIÓN
En el síndrome de Hunter (MPSII), ó mucopolisacaridosis tipo II la enzima Iduronato 2- Sulfato Sulfatasa (IDS) ha perdido su funcionalidad; ésta sulfatasa lisosomal hace parte del catabolismo de dos glicosaminoglicanos (GAGs), tales como los sulfatos de heparán y dermatán (Scriver et al, 2001). De este síndrome se conocen dos formas clínicas
diferentes: la forma leve (MPSII B) y la severa (MPSII A). En la secuencia de la IDS se encuentran ocho sitios potenciales de N-glicosilación (Millat, et al 1997). En esta enfermedad, como en otros errores innatos del metabolismo, el defecto se halla a nivel del gen que codifica para la enzima, lo cual, la convierte en una patología intratable mediante la terapéutica convencional. Por ser una “enfermedad rara” dada su incidencia, el manejo de MPS II, tradicionalmente ha estado dirigido a la corrección de las manifestaciones clínicas de la enfermedad; en este sentido, el uso de audífonos y la terapia ortopédica han sido de utilidad. Sin embargo, la búsqueda de soluciones terapéuticas, ha llevado a diferentes ensayos como, proporcionar a los pacientes la enzima IDS activa mediante Terapia de Reemplazo Enzimático (TRE). Mediante esta técnica en la actualidad se ofrece comercialmente, elaprase®, idursulfasa®. La TRE ha mostrado efectividad en otros desordenes metabólicos como el Síndrome de Gaucher, Fabry, Hurler, Maroteaux- Lamy y Pompe. (Brady et al, 1973). Para TRE se pueden emplear modelos más económicos respecto a las líneas celulares, como lo son E. coli y levaduras, y su caracterización bioquímica, con lo cual se ha abierto una ventana de esperanza para el tratamiento del Síndrome de Hunter. En el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo (IEIM) se ha logrado avanzar en la Expresión de la IDShr tanto en
Escherichia coli, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha como modelos expresión recombinantes de expresión de proteína; como también, se están estudiando alternativas como la Terapia Génica, o las Células Madre. (Acero, J 2004) (Garzón, K 2006) (Gutiérrez, M 2005) (Landázuri, P 2002) (Poutou, RA 2006)
En trabajos previos realizados por la doctora Patricia Landázuri de la Universidad del Quindío, se extrajo el ADN de la IDShr del plásmido pUC13-IDSh (plásmido donado por el Doctor Tomatsu, de la Universidad de Saint Louis) el cual se insertó en el plásmido pGEX-3X . Este constructo, pGEX-3X/IDS se electroporó, en dos diferentes cepas de E. coli, BL21 y DH5α, se evidenció experimentalmente actividad biológica de la proteína producida en con el clon DH5α/pGEX-3X/IDS.
En este trabajo, se presentan los pasos principales que se deben tener en cuenta para evaluar un microorganismo transformado genéticamente, teniendo en cuenta técnicas como PCR, digestiones enzimáticas, y otras más especificas para verificar la expresión del gen insertado, usando Western blot y ELISA Indirecta.
Para escalar la producción de la IDShr, suficiente para estudios de TRE, será necesario posteriormente, evaluar la producción y actividad de la proteína en los transformados en los medios tradicionales recomendados por Invitrogen a nivel de matraz erlenmeyer agitado.
2. Materiales y Métodos
2.1 Microorganismos
Los clones BL21/pGEX-3X/IDS y DH5α/pGEX-3X/IDS, obtenidos por Morales D.,2007, y las cepas BL21 y DH5α como controles negativos fueron conservados a –80 °C en LBA/LB con glicerol al 30%, luego se inocularon 300 μl en 2.7 ml de medio LBA/LB fresco, se crecieron a 37°C por 16 h como inóculo. De 10 ml del anterior cultivo se inocularon a 90 ml en medio LBA/LB fresco, se crecieron por 3h a 37°C. Al cultivo del clon BL21/pGEX-3X/IDS se le adicionó IPTG a una concentración final de 1mM y se creció a las mismas condiciones por 4 horas. (Espejo, AJ; Sosa, AC. 2003)
2.2. Lisis Celular
Se centrifugaron los cultivos de todos los clones y cepas nativas a 3800 rpm por 15 minutos a 4° C, resuspendiendo la biomasa en el buffer de lisis. Para realizar la lisis celular se preparó el buffer de Lisis (Tris HCl 50 mM , NaCl 300 mM, 10mM de Imidazol, 0.05% Tween 20, Ajustando el pH a 8.0 y adicionando finalmente 1 mM de DTT y 1 mM PMSF). Después de resuspendidas las muestras en el buffer se sonicó por 1
s y 2 s de descanso en durante 12 min, con una amplitud de 20%. Luego de la ruptura se centrifugó a 3800 rpm por 15 minutos a 4° C, y se guardaron los sobrenadantes a -20°C. Este método consideró el usado en el trabajo de Espejo, AJ; Sosa, AC. 2003, y de la tesis doctoral de Landázuri, P. 2002 tomando modificaciones de cada uno.
2.3. Extracción ADN Plasmídico Mini Prep
Una colonia aislada en Agar LB- Ampicilina 100μg /ml se resuspendió en 3 ml de caldo LBA a 37°C y se creció durante 16 horas, luego se centrifugó la biomasa a 13200 rpm por 4 min a temperatura ambiente, se descartó el sobrenadante y se adicionaron 100μl de la solución I ;se mezcló por inversión y vórtex para resuspender totalmente la biomasa. Luego se adicionaron 200μl de la solución II, mezclando por inversión y dejando en reposo por 5min, para posteriormente se adicionó 150μl de la solución III. Después se dejó la mezcla en reposo por 1 hora a 4°C. Seguidamente se centrifugó a 10000 rpm por 5 min a temperatura ambiente, el sobrenadante se pasó a un tubo estéril, y se adicionó 1ml de Isopropanol al 95%, luego se centrifugó por 15 min a 10000 rpm y se removió el isopropanol. Se lavó el pellet con 0.5ml de etanol al 70% dos veces, se dejó secar en horno el exceso de etanol y se resuspendió en 50μl de Buffer TE. (Sambrook, 2001)
2.4. Digestiones Plásmido pGEX3X/IDS
Se realizaron dos diferentes digestiones para comprobar los tamaños moleculares tanto del inserto como del plásmido en su totalidad, para la primera reacción se empleó la enzima Sma I, y en la segunda reacción se empleó EcoR I.
2.5. Diseño de Primers para amplificar el gen de la IDS
Se diseñaron dos parejas de primers en el programa PRIMER3 (v. 0.3.0)1 y con los criterios estándar del programa, para verificar la presencia del inserto y la direccionalidad del mismo. Esto se realizó sobre la secuencia del constructo pGEX3X/IDS.
La primera pareja de primers (pGEX-F y pGEX-R) se diseñó para que ésta se anillara sobre el plásmido pGEX-3X en los extremos flanqueantes de la IDS, y producir un fragmento de 1489pb. La segunda pareja de primers (IDS –F y pGEX-R) amplificará un fragmento de 813pb, el cual corresponde a la mitad del ADNc de la IDS, lo que permitió confirmar la direccionalidad del inserto. Las condiciones se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Condiciones PCR
Condiciones para amplificar primera pareja Condiciones para amplificar segunda pareja Paso Temperatura Tiempo Nro.
de ciclos
Paso Temperatura Tiempo Nro. de ciclos Denaturación inicial 95°C 5´ 1 Denaturación inicial 95°C 5´ 1 Denaturación 95°C 1´ 30 Denaturación 95°C 1´ 30 Anillamiento 60°C 1´ 30 Anillamiento 56°C 1´ 30 Extensión 72°C 1.5´ 30 Extensión 72°C 1.5´ 30 Extensión final 72°C 10´ 1 Extensión final 72°C 10´ 1 Sostenimiento 4°C --- 1 Sostenimiento 4°C --- 1
1
2.6. Determinación de la concentración de proteínas totales.
Además, se utilizó la técnica de Bradford, en la cual se colocaron 4 μl de muestra y 196
μl del reactivo Bradford (Biorad). La curva de calibración se realizó con suero de albúmina bovina, en el rango de 1.4 a 0.875 mg/ml.La mezcla se leyó en un lector de placas Anthos 2020 Reader (Anthos Lactec Instruments®) a 620 nm. Como referencia se toma la curva de calibración con albúmina, aunque para cada medición de proteínas se empleó una curva de calibración distinta. (Dawson, R. M. C, 1986).
2.7. Determinación de biomasa
Una colonia aislada en Agar LB- Ampicilina (LBAmp) 100μg/ml se resuspendió en 10ml de caldo LBAmp 100μg/ml, y se creció a 37°C por 16h. El crecimiento se inoculó en 90ml de medio fresco LBAmp 100μg/ml; a partir de éste momento y durante las 6 horas subsecuentes se tomaron muestreos de 1 ml cada hora. Se realizaron diluciones decimales seriadas hasta obtener la concentración óptima para realizar recuento de colonias (UFC/ml). A partir de la dilución apropiada se sembraron 100 μl en superficie en agar LBAmp 100μg /ml, se incubó a 37°C por 24 horas y se leyeron los resultados (Allaert, C et al; 2002)
2.8 Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
La electroforesis de proteínas se realizó en un gel de poliacrilamida al 10% en condiciones reductoras, diluyendo las muestras en Buffer Laemmli (Biorad®) adicionado con 2-mercaptoetanol (SIGMA). Las condiciones de corrido se mantuvieron a 120V 60 mA durante 2 horas. Finalmente, los geles fueron teñidos con azul de coomasie y el peso molecular de las muestras se determinó comparando las bandas obtenidas con el marcador de peso molecular utilizado SigmaMaker High, SIGMA®. (Walker J; 2002
)
2.9. Detección de la IDShr por Western blot
Después de realizar un corrido electroforético de los lisados bacterianos, los geles fueron transferidos a una membrana de Nitrocelulosa HIBOND C-Extra 0.22μm (Amersham), la cual debía ser previamente activada con un buffer de Transferencia pH 8.3 (Tris Base, Glicina, Metanol, SDS) durante 2 horas manteniendo como condiciones de transferencia 100V y 350mA. La membrana se bloqueó con solución de bloqueo (TBS, Tween 0.1 %, Leche descremada 5%) durante 2 horas a temperatura ambiente. Cada una de las membranas se incubó con su respectivo anticuerpo primario, IgY α IDS producido en gallina y anticuerpo IgY preinmune, en una dilución de 1/2000 y se incubó en las condiciones descritas anteriormente. Posteriormente se realizaron cinco lavados de 5 minutos cada uno con TBS – Tween 20 0.2%. Se adicionó el anticuerpo secundario antichicken IgY HRP (PROMEGA) en una dilución 1/2000 durante una hora. Se realizaron nuevamente lavados y por último la reacción se reveló utilizando una solución de Imidazol, TritonX100, Diaminobenzidina y Peróxido de Hidrógeno. (Sosa A, Barrera L.A. 2005)
2.10. Determinación de actividad específica de la IDShr
Para la determinación de la actividad enzimática de la IDShr se empleó un sustrato fluorométrico llamado 4-metilumbeliferil - α - iduronato 2- sulfato (125mM). A 10μl de
muestra se adicionó 20 lde buffer del sustrato (CH3 COONa/CH3COO Y Pb
(CH3COO)2.3H2O 10mM; la mezcla se incubó a 37°C durante 4 horas, al cabo de este
tiempo se adicionó 40μl de Buffer Pi/Ci, (NaH2PO4 0.4M, C6H5Na3O7. 2H2O 0.2M pH
4.5 y NaN3 0.02%) y 10 μl de LEBT (Suspensión de enzimas lisosomales de hígado de
conejo parcialmente purificadas). Esta última mezcla se incubó por 24h a 37°C. La reacción se detuvo con 650μl de buffer de parada (NaHCO3/NaCO3 0.5M, pH 10.7, con
Glicina 1.7mM). La fluorescencia se determinó en un fluorometro Turner 450, a 360 nm de excitación y 415 nm de emisión. Como control se emplearon los sobrenadantes de las rupturas celulares de los cultivos de las cepas sin el inserto. La actividad se expresa en nanomoles de sustrato convertido por hora por miligramos de proteína total (nmolh-1mg-