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En una primera oportunidad se extrajo la proteína intracelular producida por la cepa DH5-α/pGEX-3X/IDS, mediante protocolo de ruptura establecido en Morales D., en 2007; el sobrenadante del lisado mostró la presencia de IDShr, midiendo actividad biológica como se muestra en la tabla 4.

El trabajo se inició evaluando el cambio de la crecimiento celular, tanto en los cultivos con el clon DH5α/pGEX3X/IDS que se encontraba almacenado en el IEIM a -80°C como con el clon BL21/pGEX3X/IDS; este último conservado en la Universidad del Quindío. Se encontró que el clon DH5α/pGEX3X/IDS alcanzó una mayor crecimiento celular en un tiempo similar respecto a la del clon BL21 pGEX3X/IDS como se observa en la tabla 8. La cepa DH5α se usa como una cepa para subclonaje y no necesita de IPTG para inducir la expresión de la proteína, puesto que en su genoma no tiene el gen lac Iq (INVITROGEN, 2004); mientras que la cepa BL21 utilizada específicamente para expresar proteínas, necesita de un elemento inductor de éste gen, y por referencias bibliográficas se conoce que el IPTG reduce notablemente la velocidad de crecimiento, (Vilar et al; 2003), lo cual se evidenció (Figura 20). Por tanto, se verificó que el clon BL21/pGEX3X/IDS es promisorio para la expresión de la IDShr y efectuar estudios de escalado, tal como está reportado en la literatura para muchas otras proteínas y como es recomendado por el fabricante de la cepa BL21 (Amersham Bioscience).

Luego de conocer las diferencias en el crecimiento de las dos cepas, fue necesario establecer un protocolo de sonicación para extraer las proteínas intracelulares solubles presentes en los clones BL21 pGEX-3X/IDS y DH5-α/pGEX-3X/IDS. Se partió de las condiciones establecidas en Espejo y Sosa en 2003 y como se muestra en la figura 17 no se evidenció el patrón de bandeo característico lo cual podría deberse a una ruptura celular incompleta. Para mejorarla se consideró que la efectividad de este proceso dependía del número de ciclos y la energía aplicada al medio (amplitud), sin embargo, altos valores en estos dos factores pueden afectar la actividad biológica de la proteína analizada (Walker, J; 2002). Según las guías para

producir una proteína recombinante con los plásmidos pGEX, se recomienda que al someter las muestras a proceso de sonicado, no se debe exceder un tiempo de exposición de 10 minutos continuos para evitar la formación de espuma y sobrecalentamiento de la muestra (Amersham Biosciences, 2002). Por éstas razones y teniendo en cuenta la duración del ciclo de rompimiento establecido en el trabajo de Espejo y Sosa en 2003, se fijaron tiempos de descanso de 2 segundos dentro de los ciclos de sonicado. Mediante la técnica de Bradford como se puede observar en la tabla 9 y las electroforesis de lisis celular (Figura 18), se confirmó que a medida que aumentaba el tiempo de sonicado las proteínas presentes en el sobrenadante intracelular aumentaban significativamente. También se observa que las condiciones ensayadas en el procedimiento de ruptura celular, no afectaron las proteínas en el sobrenadante, ya que no se observa proteína degradada. En los ensayos con quince minutos de sonicado se observó un patrón de bandeo característico de un proteínas degradadas (datos no mostrados). Estos ensayos permitieron establecer las condiciones apropiadas para la ruptura celular de los clones, determinando que al utilizar 12 minutos de sonicación, con pulsos de 1 s y descansos de 2 s a una amplitud del 20%, se obtienen mayores concentraciones de proteínas (Figura 18B) sin sobrecalentamiento de la muestra o formación de espuma.

Con los lisados celulares obtenidos a partir de las rupturas se establecieron, inicialmente para la cepa BL21/pGEX3X/IDS, las condiciones para implementar la técnica de Western blot, para la cual, se estandarizaron las concentraciones de anticuerpo conjugado a partir de las establecidas por Sosa y Barrera en 2005. Se consideraron dos concentraciones de Anticuerpo conjugado (Figura 21) para comprobar que en este rango de dilución 1/1000 a 1/2000, éste no se unió inespecíficamente a otras proteínas del extracto celular (figura 21-3; 21-4). Variando las concentraciones de anticuerpo primario se logró establecer que una dilución 1/2000 produjo un menor ruido de fondo, y mantuvo el reconocimiento de la IDShr de TKT (figura 22).

El anticuerpo primario utilizado fue diseñado contra la región que se encontraba corriente abajo del primer IDS-f (figura 12), con el cual se comprobó en estudios

previos de Sosa, A y Barrera, LA en el 2005 que el extracto de los anticuerpos obtenidos de yema de huevo reconocieron la proteína IDShr. Sin embargo, debido a que los extractos de anticuerpo contienen diferentes tipos de inmunoglobulinas, tales como IgA, IgM, e IgY. (Schade, R et al 2005), en el IEIM se realizaron nuevos trabajos en la purificación de estos anticuerpos por medio de una columna tiofílica incrementando la especificidad en el reconocimiento de la proteína de interés. La efectividad de éste método se comprobó en otros trabajos del IEIM, utilizando los anticuerpos purificados para la detección de IDShr expresada en Pichia pastoris donde no se observó reactividad cruzada con otras proteínas propias de la levadura.

En este trabajo, utilizando las diluciones establecidas de 1/2000 tanto para el anticuerpo primario como para el conjugado, se realizó un ensayo empleando los extractos celulares de los clones BL21/pGEX-3X/IDS, DH5-α/pGEX-3X/IDS y sus respectivos controles negativos. En la figura 23 se muestra que el anticuerpo primario reconoció 2 proteínas diferentes dentro de las cuales se observó unas banda alrededor de los 40kDa, 80 kDa, peso molecular correspondiente a las proteínas de interés esperadas, no glicosiladas, teniendo en cuenta que estas formas la mas pesada 80 kDa tiene la IDShr (aproximadamente 55 kDa) y el de la GST (aproximadamente 26 kDa) ; la de 40 kDa como se explica según Morales, D en 2007 como una modificación proteolítica de la IDShr y como la forma de la proteína sin el gen de la proteína de fusión GST; sin embargo, el reconocimiento de las bandas adicionales, en los controles negativos, posiblemente se debe a que las soluciones de anticuerpos purificados contienen tanto IgYs-α IDS como otras IgYs producidas por el animal ante antígenos externos, de esta forma en el sistema de detección estos anticuerpos podrían estar reconociendo proteínas de E. coli de diferente peso molecular presentes en el extracto intracelular del mismo peso de la proteína de interés (Figura 23, carriles 2 y 3).

Ante la posible detección de la proteína se cuantificó por la prueba de ELISA Indirecta, para lo cual se estableció previamente que el clon DH5 α pGEX-3X/IDS se excluiría de los ensayos por tratarse de una cepa óptima para clonaje de fragmentos y no para expresión de proteínas. Por ésta razón, se centró el ensayo

para estudiar el clon BL21 pGEX-3X/IDS y medir la proteína presente en los extractos de lisados intracelulares de proteína soluble, obteniendo concentraciones de 714,7 [μg de IDS]/ml de muestra, para el clon sin inducir y 804,7 [μg de IDS]/ml de muestra, en el clon inducido con IPTG. Las diferencias entre éstos dos valores no fueron las esperadas, como en otros trabajos. Se comprobó este mismo resultado, midiendo la concentración de proteína total por Bradford de los extractos celulares de éste clon como se observa en la tabla 9 y 10.

Los resultados anteriores sugirieron que la IDShr se podría encontrar en forma insoluble. Se conoce en trabajos previos (Rattenholl, A et al 2001) que la cepa BL21 al expresar proteínas recombinantes, provoca un desequilibrio entre la forma soluble y la insoluble y por tanto, acumula proteínas en cuerpos de inclusión. Para hacer esta verificación se solubilizó la proteína proveniente de éstos cuerpos de inclusión, y se realizaron los ensayos como se muestra en la tabla 10, se logró solubilizar en un primer ensayo 312,75 μg/ ml de proteína total y por ELISA indirecta permitió evidenciar 29 μg IDS/ ml y en un segundo ensayo 407,75μg/ ml de proteína total y no se detectó IDS (tabla 12). Estos últimos resultados al parecer confirman que lo observado por Western Blot es un reconocimiento inespecífico en los lisados de los controles negativos.

Para confirmar los anteriores resultados se observó la estabilidad genética de los plásmidos construidos y transfectados en las cepas; para lo cual, se realizaron minipreps en los clones DH5-α/pGEX-3X/IDS y BL21/pGEX-3X/IDS y se efectuaron digestiones con las enzimas de restricción EcoRI y SmaI, como se muestra en la figura 13. El análisis de digestión permitió evidenciar que el tamaño del plásmido no coincide con el teórico calculado de 6.3 kb, pues al linearizarlo con la enzima de restricción Sma I se observó que el tamaño era aproximadamente de 4.8 kb, lo cual coincidió con la digestión realizada con EcoR I en la que se obtuvieron dos bandas de aproximadamente 3.5 kb y 1.3 kb.

A partir de éstas observaciones encontradas en el plásmido pGEX3X/IDS; se procedió a realizar la amplificación del gen de la IDS y su correcta dirección de

lectura dentro del vector y de tal manera, obtener un sistema de expresión de la IDShr con el cual posteriormente se logre escalar la producción de esta sulfatasa. En el trabajo de Morales, D, 2007 esta verificación no se efectuó. Para ello, se diseñaron dos parejas de iniciadores como se muestra en la tabla 6, con las cuales se espera amplificar el gen completo y con la otra pareja verificar la direccionalidad de la inserción. En las figuras 15 y 16 se muestran los resultados de la PCR efectuada para esta determinación.

La ausencia de amplificado tras el PCR con la pareja de iniciadores pGEX-f y pGEX-r, que fueron diseñados para anillarse en los extremos flanqueantes del ADNc de IDS permitió confirmar la sospecha de que existía una alteración en la integridad del plásmido pGEX3X-IDS en los dos clones utilizados. Luego se realizó una PCR con la segunda pareja de iniciadores (IDS-f y pGEX-r) y se observó un patrón de bandeo indicativo de la unión de un solo primer, posiblemente el de IDS-f (figura 16), pues con los otros dos no se observó este mismo patrón de bandeo. Estos resultados sugieren la pérdida de una secuencia del plásmido de aproximadamente 1.5 kb, el cual se propone sea el gen de resistencia a Ampicilina (952pb) y parte del gen de la IDS, lo cual puede ser explicado por una recombinación entre el plásmido y el genoma de la bacteria.

Los genes de antibióticos usados en los plásmidos para conferirle resistencia en un medio selectivo que contiene el antibiótico, favorece la permanencia del transformado dentro de la célula. Sin embargo, si las condiciones metabólicas o de temperatura cambian, se ha observado la eliminación total de los plásmidos o la integración del gen de resistencia al antibiótico dentro del ADN genómico (Martinez- Morales F, et al, 1999). Estos autores también proponen que este hecho puede ser mediado por transposones y replicones del plásmido, los cuales interfieren directamente en las construcciones realizadas. Otro mecanismo que explica la integración del gen de Ampicilina al ADN genómico es por medio de las integrasas, las cuales han sido encontradas en regiones conservadas de los integrones, un elemento genético involucrado en la resistencia de genes presentes en varios tipos de bacterias (Francia V, et al, 1996).

Como prueba confirmatoria se realizó la lectura de actividad enzimática de la proteína soluble proveniente de los extractos celulares, los cuales indicaron los problemas de la expresión de la proteína, éstos confirman que la IDShr producida en el clon BL21 pGEX-3X/IDS tiene una actividad biológica que se considera como no detectable o muy baja, cuando se compararon, los controles negativos frente a los clones que tenían el inserto. Una posibilidad es que la cepa transformada haya perdido parte del inserto y por tanto la posibilidad de expresar una proteína activa.