La caracterización estructural y funcional de las dos nuevas construcciones se realizó en paralelo, por lo que los resultados se van a presentar de forma conjunta. Únicamente, en aquellos casos en los que se realizaron ensayos específicos para cada una de ellas, por las características intrínsecas de las dos RNasas utilizadas, se presentarán de forma independiente. Del mismo modo, se incorporarán los resultados obtenidos con las construcciones originales de partida, para el análisis comparado de los resultados.
B1.3.1.- Caracterización estructural
En primer lugar, se realizó un análisis de aminoácidos y se calculó el coeficiente de extinción al 0,1 % (E0,1%), obteniéndose un valor de 1,46 (cm.mg/ml)-1 para la variante de α-sarcina y de 1,6 (cm.mg/ml)-1 para la variante de T1, coeficientes muy similares a las de las construcciones originales.
Figura B2. Análisis electroforético e inmunodetección de la producción y purificación de IMTXA33furαS
(izquierda) y scFvA33furT1 (derecha). En ambos casos: A) Tinción con azul de Coomassie del análisis por PAGE-SDS de las distintas fracciones recogidas durante la purificación mediante cromatografía de afinidad Ni2+-NTA de ambas inmunoRNasas. MW, corresponde con patrones de masa molecular (Bio-Rad Precisión Plus). B) Tinción con azul de Coomassie (carril izquierdo) y western Blot (carril derecho) de la fracción final
Los espectros de CD en el ultravioleta lejano registrados para IMTXA33furαS y scFvA33furT1 (Figura B3) fueron totalmente compatibles con los de proteínas que presentan un plegamiento globular en disolución, con un alto contenido de estructura secundaria en lámina β, y por tanto coherentes con lo descrito para las estructuras nativas de sus dominios (Martínez-del-Pozo et al, 1988; Pérez-Cañadillas et al., 2000; Carmichael et al., 2003; Wilkinson et al., 2009). Por otro lado, los espectros de IMTXA33furαS y scFvA33furT1, son prácticamente idénticos a los obtenidos con sus construcciones originales, sin que se aprecien diferencias atribuibles a la introducción del sitio de reconocimiento de furina en el linker entre los dos dominios.
B1.3.2.- Caracterización funcional
Como ya se ha expuesto anteriormente, las inmunoRNasas están constituidas por dos dominios funcionales claramente diferenciados, unidos por un linker: un dominio marcador que reconoce y se une específicamente al marcador tumoral, dirigiendo la acción del dominio tóxico que, una vez accede al citosol, ejerce su actividad catalítica provocando la muerte de la célula diana.
Considerando la distinta función de ambos dominios, se caracterizó funcionalmente cada dominio por separado y, posteriormente, de forma conjunta, comparando los resultados con los obtenidos previamente con las variantes originales.
Figura B3. Análisis conformacional mediante dicroísmo circular (CD) en el UV-lejano de ambas
inmunoRNasas. Espectros en el UV-lejano de IMTXA33furαS (izquierda) y scFvA33furT1 (derecha). θMRW,
Elipticidad molar por residuo, expresada como: grado·cm2·dmol−1. En ambos casos se registraron los
espectros correspondientes a las construcciones originales de las que derivan. Todos los espectros se realizaron en tampón fosfato sódico 50 mM, NaCl 0,1 M pH 7,4 con una concentración de proteína de 0,15 mg/ml. La línea discontinua corresponde al espectro de la construcción original, mientras que la línea continua corresponde al de las variantes optimizadas.
B.1.3.2.1- Caracterización funcional del dominio marcador
Se estudió la capacidad de reconocimiento y unión específica del dominio marcador, común en ambos inmunoconjugados al antígeno GPA33.
El estudio se llevó a cabo mediante un ensayo de citometría de flujo con las células SW1222-GPA33 positivas, en las condiciones descritas en Materiales y Métodos. Los resultados
mostrados en la Figura B4
confirmaron la capacidad de reconocimiento específico y unión a las células GPA33-positivas tanto para
IMTXA33furαS como para
scFVA33furT1, siendo igual de eficaces en el reconocimiento y unión al antígeno que las construcciones originales.
B.1.3.2.2.- Caracterización funcional del dominio tóxico.
Una vez demostrado que la actividad del dominio marcador no se veía alterada por las modificaciones en el linker de unión, se procedió al estudio de la funcionalidad del dominio tóxico.
Considerando la diferente actividad ribonucleolítica de cada una de las RNasas incluidas en el dominio tóxico de cada inmunoRNasa, α-sarcina o RNasa T1, se llevaron a cabo ensayos específicos para cada una de ellas. En el caso de IMTXA33furαS, se realizó un ensayo de incubación con reticulocitos, utilizado rutinariamente para analizar la capacidad de liberación del fragmento α, característico de la actividad ribonucleolítica específica de la α-sarcina frente al SRL (Sarcin-Ricin Loop) en ribosomas de mamífero.
Figura B4. Ensayo de unión mediante citometría de flujo con
células SW1222. En la imagen se observa: control SW1222 (1, rojo), scFvA33furT1 (2, naranja), scFvA33T1 (3, verde claro), IMTXA33furαS (4, verde oscuro) e IMTXA33αS (5, azul oscuro). La muestra control se refiere a células SW122 incubadas en ausencia de inmunoRNasa.
Los resultados (Figura B5) mostraron que la variante IMTXA33furαS mantenía la capacidad de liberación del fragmento α, asociada a la actividad de la toxina, exhibiendo en torno al 85% de actividad en ambas inmunotoxinas con respecto a la α-sarcina libre. Así, la IMTXA33furαS mantiene la funcionalidad de su dominio tóxico.
La RNasa T1 no presenta una diana intracelular específica, sino que degrada moléculas de RNA que estén accesibles en el citosol, con preferencia por secuencias ricas en guanina. Para determinar su funcionalidad en scFvA33furT1, se realizaron dos tipos de ensayos comparando la variante optimizada con la original. Para ello, en primer lugar, se realizó un zimograma para determinar si la construcción optimizada mantiene la actividad RNasa, utilizando poli-G embebido en un gel de poliacrilamida como sustrato.
En la Figura B6 se observa las bandas de degradación de Poli-G, tanto para la variante optimizada como para la RNasa T1 libre. La cuantificación de la actividad RNasa de la variante de furina se llevó a cabo mediante un ensayo de degradación de RNA de levadura, tal y como se ha descrito anteriormente. De este modo se puede determinar de forma cuantitativa la actividad al correlacionar la concentración de la RNasa con la aparición de nucleótidos libres, medidos como la absorbancia a 260 nM, característicos de los nucleótidos solubles.
Los resultados de correlación obtenidos en el ensayo de actividad ribonucleolítica con scFvA33furT1 fueron muy similares a los obtenidos tanto con la RNasa T1 libre como a los de la inmunoRNasa original (Figura B6), demostrándose que la actividad del dominio RNasa no se ve alterada en la variante optimizada.
Figura B5. Ensayo de actividad ribonucleolítica específica
de IMTXA33furαS usando reticulocitos como sustrato. En la imagen se muestra el gel agarosa del ensayo. La flecha indica la posición del fragmento α, característico de la actividad de la α-sarcina. Se ensayaron 2,6 y 12 pmoles de IMTXA33furαS, y 12 pmoles de IMTXA33αS. El carril C- corresponde al control de reticulocitos en ausencia de proteína.
B1.3.3.- Estudios de Estabilidad
Considerando la finalidad de estas construcciones como posibles agentes anticancerígenos en futuras terapias, es necesario comprobar que los dominios de las nuevas construcciones mantienen su actividad en ensayos de estabilidad. Para ello, se incubaron alícuotas de ambas construcciones a 37ºC en presencia de FBS (suero fetal bovino), tal y como se ha descrito en Materiales y Métodos. Tras la incubación a diferentes tiempos se repitieron los ensayos de caracterización de ambos dominios.
B1.3.3.1.- Estudio de la estabilidad del dominio marcador
Para estudiar si la actividad del dominio marcador se ve alterada tras el proceso de incubación, se realizó el ensayo de citometría de flujo con células SW1222 GPA33 positivas, en las mismas condiciones que los inmunoconjugados sin tratar. Se analizaron alícuotas de la proteína incubada distintos tiempos (0, 24, 48, y 72 horas) en FBS. El resultado mostró que la actividad de los dominios marcadores de las variantes optimizadas se mantiene sin variaciones incluso tras 72 horas de incubación (Figura B7).
Figura B6. Estudio de la actividad RNasa de scFvA33furT1. A) Zimograma comparando la scFvA33furT1
(arriba) y RNasa T1 (abajo) utilizando Poli-G como sustrato en gel. A la izquierda se muestran las referencias de peso molecular de los patrones (Kda). En el eje de abscisas se muestra la cantidad de RNasa o InmunoRNasa utilizada para cada banda. B) Ensayo de degradación de RNA de levadura realizado con las inmunoRNasas scFvA33T1 y scFvA33furT1 y la RNasa T1. Se representa la absorbancia a 260 nM como medida de la aparición de oligonucleótidos solubles frente a las distintas cantidades de proteína.
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B.1.3.3.2.- Estudio de la estabilidad del dominio RNasa
Para el estudio del mantenimiento de la actividad RNasa en estos ensayos de estabilidad se llevaron a cabo los ensayos de reticulocitos y de degradación de RNAde levadura para IMTXA33furαS y scFVA33furT1, respectivamente. Realizándose los ensayos en las mismas condiciones que se exponen en Materiales y métodos, y comparando las muestras incubadas a distintos tiempos frente a sus variantes originales y la α-sarcina o RNasa T1 libres.
En la Figura B8 se muestran los resultados correspondientes al ensayo con reticulocitos, observándose en todos los casos la aparición del fragmento α, propio de la acción de la toxina sobre el ribosoma. El estudio cuantitativo de las bandas de la variante optimizada mostró que, tras 72 horas de incubación, se mantiene una actividad del 85% frente a la IMTXA33αS no tratada. De esta forma, se demuestra que la actividad del dominio marcador se conserva en estas condiciones.
Figura B7. Ensayo de unión tras la incubación en FBS mediante citometría de flujo con células SW1222.
De izquierda a derecha, se muestran las gráficas de la IMTXA33furαS y scFvA33furT1. En barras de abcisas se muestra el control de las células sin proteína (sw) y con la proteína tras ser incubada a cada uno de los distintos tiempos (0 a 72 horas).
Para determinar si scFvA33furT1 mantiene su actividad RNasa en estas condiciones, se estudio su actividad frente a RNA de levadura. Los resultados mostrados en la Figura B9 confirmaron que la actividad es similar a la obtenida con la inmunoRNasa sin incubación previa, demostrándose que la actividad del dominio RNasa permanece inalterada.
Figura B8. Ensayo de actividad ribonucleolítica específica usando reticulocitos como sustrato, comparando
la actividad de la IMTXA33furαS, incubada distintos tiempos en FBS a 37ºC, con la IMTXA33αS y la α- sarcina. A) Gel de agarosa con las diferentes muestras del ensayo. La flecha Indica la posición del fragmento α. Se ensayaron 6 pmoles de cada proteína. B) Cuantificación de la actividad relativa de cada muestra comparado con la α-sarcina (100%) en condiciones estándar.
Figura B9. Ensayo de degradación de RNA de levadura para comprar la actividad RNasa de
scFvA33furT1 tras la incubación a distintos tiempos en FBS a 37º C. Se representa la absorbancia a 260 nM como medida de la aparición de oligonucleótidos solubles frente a las distintas cantidades de proteína. Indicando junto a la leyenda de cada curva el tiempo de incubación previo.