Performance

• Determinación del número más probable de Coliformes totales,

por la técnica de Tubos Múltiples.

Definición del Grupo Coliforme

El grupo coliforme incluye, todos los bacilos gram-negativos, aerobios o anaerobios, facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas, dentro de 24-48 horas 35ºC.

La determinación del NMP (Número más probable) de bacterias coliformes en una muestra se hace a partir de la técnica de tubos múltiples, en la cual volúmenes decrecientes de la muestra, son inoculadas, en un medio adecuado.

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La combinación de los resultados positivos y negativos, es usada en la determinación NMP, el método consta de tres etapas:

- Prueba presuntiva

- Prueba confirmativa; y

- Recuento total o prueba complementaria.

La prueba presuntiva

Consiste en colocar volúmenes determinados de muestra en una serie de tubos contenido caldo de lauriltriptosa y son incubados a 35ºC ± 0,5ºC durante 24 - 48 horas, en ésta prueba presuntiva, la actividad metabólica de las bacterias es estimulada vigorosamente y ocurre una selección inicial de organismos que fermentan la lactosa con producción de gas.

La formación de gas a 35ºC ± 0,5ºC dentro de las 24 horas, constituye una prueba presuntiva positiva para indicar la presencia de bacterias coliformes. La prueba presuntiva no debe usarse rutinariamente sin confirmación para análisis de agua.

De acuerdo al objetivo del estudio, en algunos casos, se puede usar la prueba presuntiva sin confirmación; por lo general debe realizarse la prueba confirmativa.

Prueba confirmativa

La prueba confirmativa, consiste en transferir todos los tubos positivos de la pruebas presuntiva, a tubos conteniendo caldo lactosado, con bilis y verde brillante al 2 % y son incubados durante 24 – 48 horas 35ºC, esta prueba reduce la posibilidad de resultados falsos gas – positivos, que pueden ocurrir por la actividad metabólica, de los organismos formadores de esporas o por la producción sinergística de gas debido a que algunas cepas bacterianas, no pueden individualmente producirlo, a partir de la fermentación de la lactosa.

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El caldo lactosado con bilis y verde brillante, contienen agentes selectivos e inhibidores que suprimen el desarrollo de todos los organismos no coliformes.

La producción de gas 35ºC, después de 24 – 48 horas constituye una prueba confirmativa positiva.

Prueba complementaria

La prueba complementaria, consiste en transferir, por inoculación en estrías, las bacterias a partir de tubos de caldo lactosado con bilis y verdes brillante positivos a placas con agar endo o agar eosina azul demetileno (E.A.M.), luego son incubadas a 35ºC ± 0,5ºC durante 24 ± 2 horas.

Se considera positivas las colonias típicas que son nucleadas, con o sin brillo metálico y las colonias atípicas que son apacas, anucleadas, mucoides y de color rosado.

Colonias típicas y atípicas, son transferidad a tubos con caldo lauriltriptosa y tubos con agar inclinado. Será prueba complementaria positiva, cuando haya producción de gas a partir de la fermentación de la lactosa y por examen microscópico, sea demostrada la presencia de bacilos gram-negativos no esporulados, en las bacterias desarrolladas en agar inclinado.

Esta prueba se aplica en el examen de muestras de agua, si los resultados son aplicados en el control de la calidad del agua potable. También se recomienda, cuando existe alguna duda, sobre la validez de la prueba confirmativa.

Aplicación

El procedimiento del NMP para la determinación de coliformes totales, puede ser usado, para evaluar la potabilidad de las aguas tratadas, o como indicador de la calidad bacteriológica de las aguas naturales y contaminadas.

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Ventajas

La prueba presuntiva y confirmativa consiste en observar la presencia o ausencia de gas, para lo cual se requiere mínima experiencia.

Muestra de aguas con alta turbidez y gran número de algas, no producen aparentemente efectos nocivos en la reacción de los tubos.

Limitaciones

El tiempo requerido para las pruebas pueden ser 96 horas, con la prueba confirmativa. El requerimiento de horas-hombres, para la preparación del material de vidrio y de medios de cultivo para la prueba es significativo.

Equipos, materiales, medios de cultivo y reactivos

• Estufa para esterilización en calor seco.

• Autoclave, de tamaño suficiente para permitir la circulación de vapor, con termómetro calibrado.

• Incubadora de aire caliente, equipada con termostato de temperatura regulable.

• Balanzas, con capacidad de 200 a 300 gramos, alta sensibilidad. • Destilador de agua, deber producir agua no tóxica que pueda

impedir el desarrollo de bacterias.

• Medidor de pH, capaz de dar lecturas con una exactitud de ± 0,1 unidades de pH.

• Contador de colonias, con campo oscuro o similar, que tenga visibilidad satisfactoria.

• Mechero de Bunsen. • Microscopio.

• Frascos para la toma de muestras, de vidrios neutro o plásticos autoclave, no tóxico, con capacidad mínima de 125 ml de boca ancha y tapa esmerilada.

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• Frascos para agua de dilución, estas botellas o tubos deben ser de borosilicato u otro vidrio no corrosible, con tapa de rosca, de preferencia con una graduación de 90±2 ml, dejando un espacio suficiente para permitir una buena homogeneización.

• Pipetas con perilla de goma.

• Tubos de ensayo de borosilicato (pyrex) o vidrio neutro, de 18mm x 180mm; 16mm x 150 mm; y de 75 mm x 100 mm.

• Material para la preparación de medios de cultivo, recipiente de vidrio o acero inoxidable.

• Placas Petri, deben ser de borosilicato( pyrex) o vidrio neutro de buena calidad, con fondo preferentemente plano, sin ranuras, con medidas de 15 mm de altura x 100 mm de diámetro.

• Asas de inoculación, de platino o níquel –cromo, con un aro de 3 mm de diámetro.

• Láminas porta objeto.

• Estuches para pipetas y placas Petri, de acero inoxidable o aluminio; para proteger el material en la esterilización y durante su almacenamiento.

70 Medios de Cultivo y reactivos

CUADRO N° 2

Concentración adecuada de caldo lauriltriptosa (clt) en compensación al volumen de muestra empleada Tubos con CLT en ML Volumen e muestra en ml Concentración del medio Gramos de CLT por litro 10 10 20 0,1 s1,0 10 10 1 x 2 x 1,5 x 35,6 71,2 53,4

Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis 2 %

Agar Eosina Azul de Metileno (EAM)

Agar nutritivo Agua de dilución Solución Stock a Fosfato monopotásico (KH2PO4) 34,0 g Agua destilada 500 ml Preparación:

Disolver el fosfato monopotásico en 500ml de agua destilada, ajustar el

pH para 7,2 NaoH 1 N completar el volumen a un litro con agua destilada.

Solución Stock B

Sulfato de magnesio (Mg SO4 7H2O) 50,0 g

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Preparación:

Disolver el sulfato de magnesio en un litro de agua destilada.

Preparación del agua de dilución:

Agregar 1,25 de la solución Stock (A) de fosfato monopotásico y 5ml de la solución Stock (B) de sulfato de maganesio a un litro de agua destilada. Distribuir en cantidades que aseguren lugar de autoclavear durante 15 minutos a 121ºC volumen de 90± 2ml.

Reactivos para la coloración de Gram

Solución de cristal violeta

Solución de Lugol

Solución Safranina

Alcohol-acetona

Muestreo

Para la toma de muestras bacteriológicas se deben usar frascos estériles con capacidad de 125 ml. El método de colección se determina por el objetivo del estudio.

Para recolectar la muestra se sumerge rápidamente el frasco debajo de la superficie del agua unos 15 ó 20 cm para de esta manera evitar recolectar material flotante y dirigiendo la boca de la botella en sentido contrario al de la corriente, para prevenir el contacto del agua con las manos.

El tiempo de transporte al laboratorio no debe exceder las seis horas. Debido a la gran influencia que la temperatura ejerce en la población bacteriana, es importante que se mantengan refrigeradas a 4ºC, manteniéndose la muestra refrigerada aún después de su llegada al laboratorio y el análisis comenzarse de inmediato o máximo a las dos horas siguientes a su llegada.

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CUADRO N° 3

Rango de volumen de Muestra para Coliforme Total Fecal- Método de Tubos Múltiples

TIPO DE MUESTRA VOLUMEN NECESARIO ml

0,1 0,5 1,0 10

a. Agua cruda

contaminada

X x -- --

b. Agua tratada -- -- X x

Procedimiento para coliformes. Prueba presuntiva

□ Preparar una serie de tres tubos para cada cantidad de muestra con caldo lauriltriptosa y ponerle en gradillas.

□ Codificar los tubos anotando el número asignado, volumen inoculado y fecha.

□ Identificar el frasco del agua de dilución.

□ Homogenizar al muestra

□ Con una pipeta estéril trasferir 10 ml de la muestra original a un frasco con 90 ml de agua de dilución (A) correspondiente a la muestra orinal.

El cálculo es siguiente:

Volumen de muestra = dilución correspondiente

Volumen del agua de dilución + volumen de muestra

Ejemplo:

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□ Se procede de esta forma sembrando de atrás para adelante, siempre con la misma pipeta de la mayor parte para la menos dilución.

□ Incubar los tubos por 24± 2 horas 35ºC, después de la 24 horas de incubación examinar y retirar de C.L.T. positivos, o sea aquellos que presentan formación de gas en el tubo de Durham y anotar los resultados. Reincubar los tubos negativos por 24 horas más.

□ Se procede a realizar la segunda lectura de la misma forma anterior, los tubos positivos serán separados y anotados y los tubos negativos serán despreciados.

□ A partir de la suma de los resultados obtenidos en la primera lectura (24 horas) y segunda lectura (48 horas) se calcula el NMP de coliformes, por medio cuadro 3.

□ Si el objetivo del estudio exige la prueba confirmativa, a todos los tubos positivos de la lectura (24 horas) y (48 horas) de la Prueba Presuntiva pasan a la prueba confirmativa, inmediatamente después de las lecturas respectivas.

Prueba confirmativa para coliforme total

□ Se utiliza como medio de cultivo caldo lactosado verde brillante bilis 2%.

□ Marcar los tubos de caldo lactosado verde brillantes bilis correspondiente respectivamente, a cada tubo positivo de caldo lauriltriptosa de la prueba presuntiva.

□ Agitar bien cada tubo de C.L.T. presuntivo positivo y con una asa de niquel- cromo previamente quemada y enfriada, extraer una azada del material e inocular en el tubo de caldo lactosado verde brillante bilis (C.L.V.B.B) evitando tocar la película superficial que puede formarse en el evitando tocar la película superficial que puede formarse en el lauriltriptosa.

□ Incubar todos los tubos de C.L.V.B inoculados durante 24 -48 horas 35±0,5ºC.

□ Proceder a la lectura luego de las 48±3 horas, considerando prueba positiva confirmativa para coliforme total a todos los tubos que presentan formación de gas en el tubo de Durham invertido.

□ Anotar los resultados y calcular el NMP a partir de los datos obtenidos, en la prueba confirmativa.

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Prueba complementaria.

Se utiliza si la finalidad del estudio es el examen completo, procediendo de la siguiente forma:

□ Se marca las placas de EAM., correspondiendo cada a un tubo de caldo lactosado verde brillante bilis (C.L.V.B).

□ Quemar y enfriar un asa de níquel-cromo, cuya parte final está formada de un aro de 5 mm de diámetro.

□ Agitar e inclinar el tubo de C.L.V.B., sumergir el asa en el líquido del tubo y extraer una azada del material.

□ Sembrar el inóculo, esparciendo en la superficie del primer cuadrante de la placa Petri conteniendo Agar E.A.M., y cuidando de no romper el agar, girar la placa y continuar el esparcimiento en el segundo cuadrante a partir del inóculo del primer cuadrante.

□ Continuar de esta forma hasta completar el esparcimiento en todo el agar.

□ Continuar de esta forma hasta completar el esparcimiento en toda la superficie del agar.

□ Cerrar e encubrir la placa en posición invertida durante 24±2 horas a 35±0,5ºC.

□ Las colonias positivas son las colonias típicas (son colonias rasado- oscuro con núcleo central, con o sin brillo verde metálico), o las colonias atípicas (son colonias rosadas, mucoides, opacas, sin núcleo).

□ Las colonias negativas son las transparentes.

□ Seleccionar tres colonias, escogiendo dos típicos y una atípica y sembrar cada una de ellas en un tubo de caldo lauriltriptosa y un tubo de agar inclinado.

□ Incubar el caldo lauriltriptosa durante 24- 48 horas y el agar inclinado durante 24 horas, amnos a 35±0,5ºC.

□ Preparar una suspensión de cada cultivo de agar inclinado, correspondiente a cada tubo de C.L.T que haya revelado presencia de gas a partir de las colonias en E.A.M.

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Preparación de la coloración Gram

□ Limpiar bien lámina de vidrio, para librar librarla de cualquier traza de película oleosa.

□ Colocar una gota de agua destilada sobre la lámina.

□ Con un asa de inoculación colectar una pequeña cantidad del crecimiento bacteriano en la superficie del agar inclinado y suspenderla en la gota de agua.

□ Con la punta del asa de inoculación esparcir sobre la lámina de manera que forme una película bien delgada.

□ Fijar la suspensión pasado la lámina tres veces sobre la llama.

□ Cubrir la suspensión pasando fijada, con solución de cristal violeta, durante un minuto.

□ Remover el exceso de cristal violeta de la lámina, lavándola brevemente con agua corriente.

□ Cubrir con solución de lugol durante un minuto.

□ Decolorar utilizando una solución de alcohol-acetona (1.1).

□ Cubrir durante 15 segundos con solución de safranina diluida.

□ Lavar la lámina en agua corriente y secarla levemente.

□ Examinar las láminas con el microscopio usando objetivo de inmersión.

Las bacterias coliformes son bacilos Gram-negativos, coloreados de rojo y pueden aparecer en pares o raramente en pequeñas cadanas.

□ La formación de gas en el tubo de caldo lauriltriptosa provenientes de colonias de E.A.M. y la presencia de bacilos Gram-negativos no esporulados en el cultivo de agua inclinado que corresponde, es considerado ensayo completo, positivo, para la presencia de bacterias del grupos Coliforme.

Resultado

□ El cálculo de la densidad probable de bacterias coliformes totales en una muestra está basado en la combinación de los resultados positivos y negativos obtenidos en cada dilución.

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□ La densidad de coliforme total se expresa como NMP de coliformes por 100 ml.

□ El NMP se obtiene a través de tablas en las que se presentan el límite de confianza de 95% para cada valor de NMP determinado (Cuadro 4).

□ Tres diluciones son necesarias para la obtención de código del NMP. Por ejemplo en la Tabla si tenemos sembradas 3 porciones de 10 ml, 3 de 1

ml y 3 de 0,1 ml, resultado positvos, 3 de 10 ml, 2 del ml y ninguna de 0,1 ml. El código resultante para la obtención del NMP será; 3-2-0.

□ Se localiza en el cuadro 4 y el NMP será 93 por 100 ml.

□ Aunque los códigos presentados en el Cuadro 4 se refieren específicamente a la combinación de resultados positivos obtenidos, cuando son inoculados volúmenes de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml de muestra, ésta puede ser usada para volúmenes mayores o menores de siembra. Ejemplo:

Tres porciones de 0,01 ml resultaron positivas, dos de 0,001 ml y ninguno de 0,0001 ml. El código resultado será:3-2.0 se localiza el valor en el Cuadro 3 en NMP ajustando las diluciones de acuerdo a la siguiente fórmula.

Valor en la Tabla NMP_{𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑜 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛}10 = 𝑵𝑴𝑷₁₀₀ 𝑚𝑙

Reemplazando tenemos: 93x10/0,01= 93.000/100 ml

En el registro de datos se deben considerar los siguientes aspectos:

□ Número de muestra, punto de muestreo, fecha y hora de muestreo, fecha y hora de análisis, temperatura del agua y aire.

□ El cuadro No. 4.1 es una hoja de registro de datos para la prueba de coliforme total, prueba presuntiva y confirmativa.

□ Para cada muestra se va reportando los resultados de las pruebas presuntiva 24 y 48 horas y prueba confirmativa 24 y 48 horas.

□ Es conveniente indicar los medios de cultivo utilizados para casa prueba.

□ Los rangos de dilución a emplearse son de acuerdo al tipo de muestra analizada

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CUADRO N° 4 : NMP Y LIMITES DE CONFIANZA DEL 95% ENTRE LOS CUALES PUEDE VARIAR PARA DIVERSAS COMBINACIONES DE RESULTADOS POSITIVOS OBTENIDOS CON TRES PORCIONES DE (10 ml, 1 ml y 0,1 ml)

COMBINACION DE TUBOS POSITIVOS NMP LIMITE DE CONFIANZA 95% LIMITE INFERIOR LIMITE SUPERIOR 0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-2-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0 2-0-1 2-1-0 2-1-1 2-2-0 2-2-1 2-3-0 3-0-0 3-0-1 3-0-2 3-1-0 3-1-1 3-1-2 3-2-0 3-2-1 3-2-2 3-3-0 3-3-1 3-3-2 3-3-3 ‹3 3 3 - 4 7 7 11 11 9 14 15 20 21 28 - 23 39 64 43 75 120 93 150 210 240 460 1,100 ›2,400 ‹ 0,5 ‹ 0,5 ‹ 0,5 1 1 3 3 1 13 3 7 4 10 4 7 15 7 14 30 15 30 35 36 71 150 9 13 20 21 23 36 36 36 37 44 89 47 150 120 130 380 210 230 380 380 440 470 1,300 2,400 4,800

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Determinación de Coliformes Totales-Método de Filtro de Membrana

Membrana

Método de filtro de membranas

El procedimiento de filtración consiste en pasar con ayuda del vacío la muestra de agua a través de una membrana de celulosa de 0,45 micrones. La limitación en volumen depende también de la presencia de turbiedad. Cuando se trata de aguas contaminadas es necesario diluir previamente las muestras.

Para efectuar la dilución se debe tener en consideración que el número ideal de colonias en el filtro de membrana debe estar entre 20 a 80, para la determinación de coliformes totales. La muestra se filtra a través del filtro de membrana y se coloca debidamente en el soporte de filtración, con ayuda de una válvula de doble vía para vacío.

El filtro se coloca entonces en una placa Petri que contiene un medio hacia abajo y a una temperatura de 37ºC durante 18 a incubación no debe exceder de 30 minutos. Todas las colonias rosa a color rojo oscuro con brillo metálico dorado o verde amarillento son coliformes totales.

Equipos, material y medio de cultivo

(Equipo portátil y accesorios Para control bacteriológico)

Equipo y material

a) Incubadora portátil

Con capacidad para 27 muestras que mantienen la temperatura a 37ºC. Trabaja a corriente y a batería.

b) Soporte y portafiltro de acero inoxidable

Deben ser esterilizados en autoclave a 121ºC durante 15 minutos o por ebullición.

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c) Filtros de membrana

Deben presentar capacidad de retención de bacterias certificada por el fabricante y velocidad de filtración satisfactoria (los diámetros de poro, de uso bacteriológico, son 0,22 micrones para esterilizar líquidos y 0,45 micrones para retener bacterias).

Si los filtros no han sido esterilizados previamente por el fabricante deberán ser colocados en el autoclave a 121ºC 10 minutos.

d) Almohadillas absorbentes para medio de cultivo

Deben ser de papel filtro, libre de sustancias inhibidoras que interfieran en el crecimiento de las colonias y tener un espesor uniforme para permitir la absorción de 1,8 a 2,2 ml del medio de cultivo. Deben ser esterilizadas previamente en autoclave a 121ºC durante 10 minutos.

Existe la alternativa de sustituir estas almohadillas por el caldo de cultivo al que se le añade agar al 1,5%. Esta preparación debe ser cuidadosamente añadida a la placa de cultivo evitando la formación de burbujas, dejando la superficie lisa y húmeda.

e) Pinzas

Se seleccionar de preferencia las que tienen extremos redondos y punta recta. No es conveniente que tengan rugosidades, pues pueden dañar las membranas. Se deben mantener en alcohol y se flamearán antes de ser utilizadas en los análisis.

f) Placas Petri

Para la técnica del filtro de membrana se utilizan placas Petri de 50 – 60 mm de diámetro y 12 altura. Las placas plásticas que permiten cierre hermético son las más indicadas.

g) Vasos de precipitación

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h) Vasos de muestreo

De acero inoxidable.

i) Frascos de muestreo

Capacidad 100 ml estériles, de vidrio neutro o plástico autoclave, no tóxico.

j) Mechero de alcohol k) Muestreo

Para la toma de muestras bacteriológicas se deben utilizar frascos estériles con capacidad de 125 ml. La colección de muestras para el análisis bacteriológico del agua se debe realizar en la fuente, en los sistemas de abastecimiento, en tuberías principales y tanques de almacenamiento.

Para recolectar la muestra se sumerge rápidamente el frasco debajo de la superficie del agua, a unos 15 ó 20 cm. de profundidad para evitar la recolección de material flotante, y dirigiendo la boca de la botella en sentido contrario al de la corriente, para prevenir el contacto de las manos con la muestra de agua.

Procedimiento

El equipo de filtración debe estar esterilizado al comienzo de cada serie de filtraciones. Si es necesario esterilizar el equipo durante el día varías veces, es aconsejable exponer el embudo y el soporte de la luz ultravioleta durante 2 minutos; la esterilización también puede ser efectuada con agua hirviendo, durante 5 minutos. El soporte tiene acoplado un mechero de alcohol, el cual se utiliza para esterilizar el vaso de filtración.

81 CUADRO N° 5 TIPO DE MUESTRA VOLUMEN NECESARIO (ml) 100 50 10 1 0,1 Largos, reservorios X x X -- -- Pozos, vertientes X X X -- -- Fuentes superficiales de plantas de agua potable -- X x X --

□ Coloque asépticamente el portafiltro sobre el soporte y deposite el filtro con ayuda de una pinza estéril.

□ Coloque cuidadosamente la parte superior o embudo sobre la base del portafiltro y asegúrela firmemente girando el collar azul en sentido horario.

□ Sujete la jeringa al aparato de filtración, por medio de un tubo de plástico.

□ Para asegurar que no existe contaminación al comenzar las pruebas someta a filtración unos 50 ml de agua estéril, antes de iniciar filtración de muestras.

□ Vacíe la muestra en el embudo o reciente de filtración accionando la jeringa para dar inicio a la filtración.

□ Filtre la muestra, haciéndola pasar a través de la membrana de celulosa de 0,45 micrones.

□ Luego de filtrada la muestra, lave el embudo tres veces con volúmenes de

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