Phase 5 (2000 2009) 1 The Context

 Añada los reactivos a la microplaca de captura de izquierda a derecha utilizando una pipeta

de ocho canales. Limpie las puntas sobre el depósito desechable para reactivos para eliminar el exceso de reactivo antes de dispensarlo a la microplaca.

 Si no se utiliza una pipeta de 8 canales, puede usarse en su lugar una pipeta repetidora

adecuada. Dispense el DR1 en un tubo de polipropileno del tamaño suficiente para contener el volumen necesario.

 Se recomienda utilizar la técnica de pipeteado inverso para mejorar la uniformidad de la

dispensación del reactivo. El procedimiento se describe a continuación.

 Si se desea, puede estabilizarse la pipeta apoyando la parte media de las puntas de pipeta

sobre el borde superior de los pocillos de la microplaca de captura. Asegúrese de no tocar la pared de los pocillos de la microplaca de captura, ya que podría producirse una contaminación cruzada de las muestras (consulte la Figura 2 en la página 57).

1. Mezcle bien el DR1 y transfiera con cuidado el volumen correcto (según proceda, consulte la Tabla 1Tabla 1 en la página 41 o la Tabla 4 en la página 36) a un depósito desechable y limpio para reactivos.

2. Pipetee con cuidado 75 µl de DR1 en cada pocillo de la microplaca de captura, utilizando la técnica de pipeteado inverso, tal como se indica a continuación:

a. Acople puntas a una pipeta de ocho canales; asegúrese de que todas las puntas estén firmemente ajustadas.

b. Presione el émbolo de la pipeta más allá del primer tope hasta el segundo tope. c. Sumerja las puntas en el reactivo.

d. Suelte el émbolo lentamente y deje que el reactivo llene las puntas.

e. Dispense el reactivo en los pocillos de la microplaca presionando el émbolo hasta el primer tope. No suelte el émbolo hasta que las puntas de pipeta se hayan sumergido en el reactivo.

f. Vuelva a llenar las puntas y repita el proceso hasta que todos los pocillos de la microplaca estén llenos.

Observe la intensidad del color rosa para asegurarse de que se han llenado todos los pocillos de la microplaca de captura. Todos los pocillos de la microplaca de captura deben tener un color rosa de intensidad similar.

3. Cubra la microplaca de captura con una tapa para microplaca, Parafilm limpio o un elemento equivalente e incúbela durante 30-45 minutos a una temperatura de 20 °C a 25 °C.

Lavado

Lave la microplaca de captura utilizando uno de los métodos indicados a continuación.

Método del Automated Plate Washer

Mantenga siempre encendido el Automated Plate Washer. Asegúrese de que el depósito de enjuague está lleno y de que el depósito de residuos está vacío. El Automated Plate Washer enjuagará sistemáticamente el sistema para limpiarlo. Consulte el manual del usuario del Automated Plate Washer (Automated Plate Washer User Manual) si desea obtener más instrucciones.

 Asegúrese de que el depósito de lavado está rellenado hasta al menos la marca de 1 litro

con tampón de lavado. Si no es así, prepare el tampón de lavado (consulte “Tampón de lavado” en la página 39).

 _{Asegúrese de que el depósito de enjuague está rellenado con agua desionizada o destilada.}  _{Asegúrese de que el depósito de residuos está vacío y de que la tapa está bien ajustada.}  El Automated Plate Washer realiza automáticamente un cebado antes de cada lavado y un

enjuague después de cada lavado.

 _{Si únicamente se está utilizando una tira parcial de pocillos de microplaca de captura,}

coloque pocillos de microplaca vacíos en la microplaca de captura para completar la columna antes del lavado.

1. Retire la tapa para microplaca y coloque la microplaca de captura sobre la plataforma del Automated Plate Washer.

2. Asegúrese de que el Automated Plate Washer está encendido y de que la pantalla indica Digene Wash Ready (Lavado de digene listo) o P1.

3. Seleccione el número de tiras que van a lavarse pulsando la tecla Rows (Filas) y, a continuación, las teclas + o – para ajustar el valor.

4. Pulse la tecla Rows para volver a la pantalla Digene Wash Ready o P1. 5. Pulse el botón Start/Stop (Iniciar/Parar) para comenzar.

The Automated Plate Washer will perform 6 fill-and-aspirate cycles taking approximately El Automated Plate Washer realizará 6 ciclos de llenado y aspiración con una duración aproximada de 10 minutos. Tendrá lugar una breve pausa durante el programa; no extraiga la microplaca antes de tiempo.

Cuando el Automated Plate Washer haya finalizado el lavado, se mostrará el mensaje “Digene Wash Ready” o “P1”.

6. Retire la microplaca de captura de la plataforma del Automated Plate Washer cuando haya finalizado el programa.

La microplaca de captura debe tener un color blanco, y no debe quedar líquido residual rosa en los pocillos de la microplaca de captura.

7. Prosiga en “Amplificación de la señal”, en la página 62, para continuar el análisis.

Método de lavado manual

1. Extraiga el DR1 de los pocillos de la microplaca de captura colocando toallitas Kimtowels u hojas de papel absorbente de poca pelusa equivalentes sobre la microplaca de captura. 2. Asegúrese de que las hojas de papel absorbente estén en contacto con toda la superficie de

la microplaca de captura y, a continuación, invierta con cuidado la microplaca de captura. 3. Deje que la microplaca de captura escurra durante 1-2 minutos.

4. Seque bien la microplaca sobre toallitas Kimtowels limpias u hojas de papel absorbente de poca pelusa equivalentes.

Deseche con cuidado las hojas de papel absorbente usadas para evitar la contaminación con fosfatasa alcalina.

5. Utilizando el aparato de lavado, lave manualmente la microplaca de captura seis veces. Para lavarla correctamente, haga rebosar cada pocillo de la microplaca de captura con tampón de lavado. De esta forma se eliminará el DR1 de los bordes superiores de los pocillos de la microplaca de captura. El lavado comienza en el pocillo A1 de la microplaca de captura y continúa de forma serpenteante hacia la derecha y hacia abajo. Una vez llenados todos los pocillos de la microplaca de captura, decante el líquido en la pila con un

movimiento descendente enérgico. El segundo lavado se inicia en el pocillo H12 de la microplaca de captura, con un movimiento serpenteante hacia la izquierda y hacia arriba. Esta secuencia de 2 lavados se repite 2 veces más para un total de 6 lavados por pocillo de la microplaca de captura.

6. Después del lavado, seque la microplaca de captura invirtiéndola sobre toallitas Kimtowels u hojas de papel absorbente de poca pelusa equivalentes limpias y dándole firmemente 3-4 golpes suaves. Sustituya las hojas de papel absorbente y seque la microplaca de nuevo. 7. Deje invertida la microplaca de captura para que escurra durante 5 minutos. Seque la

microplaca de captura una vez más.

La microplaca de captura debe tener un color blanco, y no debe quedar líquido residual rosa en los pocillos de la microplaca de captura.