Preformulation Studies
6. PREFORMULATION STUDY
2.2.1.3.1. Obtención de cDNA
A partir de la sangre heparinizada de la Llama 9204 (primera biblioteca) y de la Llama 5024 (segunda biblioteca) se aislaron células mononucleares por centrifugación en gradiente de Ficoll@Hypaque (Pharmacia). El RNA total fue purificado con TRIZOL (Pharmacia) y a partir de éste se sintetizó cDNA. Para esto se incubaron 3 eg de RNA y 1,5 eg de oligo@dT30 en 7,5 el durante 10 min a 70°C y luego se enfrió en hielo. Se agregó dNTPs
0,4 mM, RT buffer 1X, 200U M@MLV RT (Promega) y 25U RNAsin (Promega) en un volumen total de 25 el y se incubó 1 h a 42°C. Se detuvo la reacción a 70 °C por 15 minutos.
El cDNA codificando el dominio VHH completo y parte de la región bisagra se amplificó por PCR empleando los primers VH1Back@SfiI o VH6Back@SfiI en combinación con el primer Lamb7@NotI o Lamb8@NotI teniendo de esta manera 4 reacciones de PCR diferentes.
Capítulo 2
MATERIALES Y MÉTODOS
____________________________________________________________________
Los primers VHBack@SfiI corresponden a secuencias consenso del extremo N@terminal del VHH. Los primers Lamb7@NotI y Lamb8@NotI hibridizan con parte de la región bisagra corta y larga, respectivamente. Sus secuencias son: VH1Back@SfiI: GCT GGA TTG TTA TTA CTC GC. .&& &+. &&. .&&ATG GCC CAG GTS MAR CTG CAG SAG TCW GG; VH6Back@SfiI: GCT GGA TTG TTA TTA TCT GC. .&& &+. &&. .&&ATG GCC GAT GTG CAG CTG CAG GCG TCT GGR GGA GG; Lamb7@NotI: G ATG GTG ATG ATG ATG T.& ..& &.& GCT GGG GTC TTC GCT GTG GTG CG; Lamb8@NotI: G ATG GTG ATG ATG ATG T.& ..& &.&TGG TTG TGG TTT TGG TGT CTT GGG. Las secuencias de restricción están subrayadas.Las reacciones de PCR constaron de un ciclo inicial de desnaturalización (5 min a 95°C), 30 ciclos de amplificación (1 min a 95°C, 1 min a 60°C y 1 min a 72°C) y un ciclo final de elongación (10 min a 72°C).
Los fragmentos resultantes de las cuatro reacciones de PCR, de aproximadamente 500 pb, fueron purificados a partir de geles de agarosa 2% (GFX PCR DNA & Gel band purification Kit, Pharmacia),
2.2.1.3.2. Obtención del vector
Para la construcción de la biblioteca se utilizó el vector de expresión en fagos pHEN2. Para obtener este vector en mayor cantidad se transformaron ! DH5α competentes, agregando el plásmido a una suspensión de las mismas en hielo durante 30 minutos, calentando 90 segundos a 42°C y 5 minutos en hielo, luego de lo cual se agregó medio LB (triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 5 g/l), se incubó 1 hora a 37°C y se plaqueó en LB@ampicilina.
A partir de las colonias obtenidas se preparó el DNA plasmídico (miniprep). El lisado de las bacterias se obtuvo con el kit Wizard Plus SV Minipreps (Promega). Para la purificación del DNA presente en el sobrenadante del lisado bacteriano se agregó un volumen de cloroformo, se agitó vigorosamente y luego de centrifugar se separó la fase superior. Luego, se agregó un volumen de isopropanol, obteniendo un pellet por centrifugación que se lavó con etanol 70% y se resuspendió en agua. El producto obtenido se analizó en un gel de agarosa 0,5%.
2.2.1.3.3. Digestión y ligación
Los fragmentos purificados y el vector pHEN2 fueron digeridos secuencialmente con las enzimas de restricción SfiI y NotI y repurificados.
Para la construcción de la biblioteca, se ligaron 5 eg del plásmido y 5 eg del fragmento digerido durante 16 hs a 16ºC. Los insertos fueron introducidos en el marco de lectura del gen de la proteína de cápside pIII en el vector pHEN2.
La reacción de ligación (200 el) se purificó con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 25:24:1, se extrajo 2 veces con cloroformo y se precipitó con 20 eg de glucógeno, 30 el de Acetato de sodio 2M pH 5.2 y 440 el de etanol durante 24 hs a @80°C. Luego de centrifugar, el
Capítulo 2
MATERIALES Y MÉTODOS
____________________________________________________________________
precipitado se lavó con etanol 70%, se secó y se resuspendió en 2 ml de H2O. Se concentrócon un centricon YM@3 (Amicon) a 15 el en agua milliQ estéril.
2.2.1.3.4. Transformación por electroporación
Para obtener células electrocompetentes ! XL Blue MRF´ se inocularon 500 ml de medio LB con 5 ml de un cultivo de 16 horas de la bacteria y se incubó a 37°C con agitación hasta una DO600nm de 0,6. Se enfrió en hielo durante 30 minutos y se cosecharon las células
por centrifugación a 4000g por 15 minutos a 4°C. Se lavaron 2 veces con 250 ml de glicerol 10% enfriado en hielo. Se resuspendió en un volumen final de 1 ml de GYT frío (glicerol 10%, extracto de levadura 0,125 % y triptona 0,25%), se fraccionó en alícuotas de 50 el y se almacenó a @80°C. La eficiencia de transformación de las bacterias electrocompetentes obtenidas fue de aproximadamente 7x108 ufc/eg de ADN.
Se procedió entonces a transformar estas células con el producto de ligación. Se realizaron 10 electrotransformaciones en un electroporador (BioRad Gene Pulser II System), cuyos parámetros se establecieron en 2,5 kV, 25 eF y 200i. Se resuspendieron las células electroporadas en 10 ml totales de medio SOC (triptona 2%, extracto de levadura 0,5%, NaCl 10 mM, MgSO4 10 mM y MgCl2 10 mM) y se incubó 1hora a 37°C con agitación para permitir la expresión de la resistencia a ampicilina otorgada por el plásmido.
Una alícuota se plaqueó en LB ampicilina 100 eg/ml en distintas diluciones para calcular el tamaño de la biblioteca. Se chequeó la diversidad por secuenciación. Al resto del cultivo se le agregó 400 ml de medio 2XYT (triptona 16 g/l, extracto de levadura 10 g/l y NaCl 5 g/l)ampicilina glucosa1%, y se creció 12 horas a 30°C.
A partir de una fracción se extrajo DNA para guardar un stock y el resto de la biblioteca se separó en alícuotas que se guardaron a @80°C en glicerol 10%.