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Uno de los aspectos importantes en la caracterización en base a marcadores moleculares de ADN es la extracción de ADN de buena concentración y calidad, siendo en vegetales un punto crítico debido a la gran cantidad y diversidad de metabolitos secundarios que producen, los cuales cumplen muchas funciones importantes en estos organismos, sin embargo pueden hacer el proceso de extracción sumamente complicado, debido a que pueden co-precipitar con el ADN durante la extracción, los complejos de polisacáridos por ejemplo pueden provocar que la fase acuosa sea excesivamente viscosa complicando la separación del ADN, o pueden adherirse a la molécula de ADN dificultando el acceso a las enzima como las polimerasas o las enzimas de restricción, siendo necesario elegir un método que se adecue al material biológico con el cual se va a trabajar (Ferreira,1998; Sánchez- Coello et al., 2012); uno de los parámetros empleados para evaluar la calidad de los ácidos nucleicos es la espectrofotometría, la cual se fundamenta en la gran capacidad de los ácidos nucleicos para absorber el paso de la luz a una longitud de onda de 260 nanometros, permitiendo medir la concentración de ADN así como determinar la pureza del ADN, mediante el ratio 260/280 el cual debe encontrarse en un rango entre 1,7 a 2,0 para ser considerado de buena calidad (Sambrook, 2001); como se observa en los resultados de extracción de ADN en las muestras de Pouteria lucuma “lúcuma”, muestreadas en los caserío de Naubamba, Conchor, Coina distrito de Usquil y de la parcela demostrativa San Carlos (Chavimochic) en el distrito de Chao, provincia de Virú, se han obtenido valores adecuados de concentración de ADN en todos los casos con valores de concentración entre 17 hasta 1344,0 ng/ul, respecto a los valores de calidad se encuentra entre 1,49 y 2,21; estos resultados de calidad concuerdan con los valores obtenidos por Sánchez (2017), donde se

trabajó con marcadores SSR en Solanum tuberosum, logrando, sin embargo,

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embargo, no fue determinante al momento de la amplificación de los marcadores por requerirse bajas concentraciones de ADN, lo cual podría llegar a ser fundamental si los contaminantes tuvieran elementos que inhiben la acción de elementos como la Taq polimerasa, tal como la presencia de compuestos fenólicos (Alfonso,2016); por esta razón en los métodos de extracción de ADN en vegetales se emplean sustancias en altas concentraciones para remover los polisacáridos como el cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) y polivinilpirrolidone (PVP) los cuales ayudan a remover los polifenoles; además, en algunos protocolos de extracción sugieren el uso de 2-mercaptoetanol pues ayuda a prevenir la degradación de ADN y reduce su oxidación (Ferrerira, 1998).

Respecto a la amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa mediante el uso de marcadores ISSR, se eligió estos marcadores moleculares, por las ventajas que ofrece como son: la alta variación que se detecta, su reproducibilidad, no requiere de altas concentraciones de ADN, no se necesita conocer la secuencia del genoma del organismo en estudio, pueden visualizarse tanto en geles de agarosa como de acrilamida y son sencillos de montar, rápidos, eficientes y poco costosos (Eguiarte et al., 2007).

Así mismo, presentan una mayor reproducibilidad y un mayor porcentaje de polimorfismo que los otros marcadores dominantes tales como los marcadores RAPDs, lo cual concuerda con los resultados obtenidos, observando amplificación en todos los marcadores ISSR utilizados y alto grado de polimorfismo (Tabla 11 y 12); sin embargo, esto contrasta con los

resultados obtenidos por Guasmi (2012) en Hordeum vulgare, donde los datos mostraron

que el porcentaje de bandas poli-mórficas RAPD (100%) fue mayor que el de ISSR (66,67%), además el número medio de bandas de amplificación RAPD (5.66) fue mayor que el de ISSR (3), siendo el número total de bandas polimórficas (17) detectadas por tres cebadores RAPD fue mucho mayor que el de los tres cebadores ISSR (6);así mismo, Reyes- Aleman (2013), concluye que tanto los marcadores basados en RAPD e ISSR fueron útiles

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para diferenciar los diferentes individuos de Persea estudiados; sin embargo, los marcadores RAPD presentaron un amplio polimorfismo y permitió una agrupación congruente en general con la taxonomía, en ambas investigaciones se podría afirmar que los marcadores RAPD son superiores a los marcadores ISSR en la capacidad de revelar bandas más informativas en una sola amplificación, este podría ser debido al tamaño de los primers, usualmente de 10 nucleótidos y que amplifican secuencias a lo largo de todo el genoma, esto de forma aleatoria, lo cual implica que podría tener variación en los resultados si se volvieran a amplificar por PCR, las mismas muestras y primers, siendo un punto en contra a los marcadores RAPDs su repetibilidad.

El proporción de Loci Polimorficos (PMF(95) (Tabla 12), muestran que todos los primers, presentan los mayores valores de loci polimoficos: respecto a la información de contenido polimórfico (PIC) es utilizado para evaluar la capacidad discriminatoria de los loci, variando entre 0 y 1, indica un mayor nivel de polimorfismo o variación cuando el valor es más cercano a 1, en los datos fluctúan entre 0,20 y 0,25; valores bajos si lo comparamos con los resultados en otras investigaciones en diferentes especies como Mentha L (Jedrzejczyk, 2018) evaluada con marcadores ISSR, con un PIC promedio de 0,434 o comparado con el

PIC promedio en 30 accesiones de Solanum tuberosum, con un promedio de 0,493 mediante

marcadores microsatelites (Sánchez, 2017); esto se podría deber al tipo de marcador empleado, a la cantidad de marcadores o también debido a que la población no presenta gran variabilidad genética.

Los valores obtenidos, además, son bajos en comparación con otras investigaciones como la

realizada por dos Santos et al (2016) trabajando en Mimosa caesalpiniaefoli donde a partir

de 7 marcadores ISSR obtuvieron un total de 78 loci, además valores más altos de contenido de información polimórfica promedio por marcador; sin embargo, respecto a la cantidad de loci polimórficos presentan valores diferentes, 41 para Mimosa y 83 para la presente

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investigación, esto podría estar en función de la población estudiada; la menor probabilidad de que dos individuos compartan el mismo alelo, fue encontrada para el primer M844 (8.2 E-12). Este valor indica que dicho primer puede presentar un alto grado de confianza para la

identificación de variedades de Pouteria lucuma, luego le siguen los primers M854 (7.1 E-

11) y M849 (1.5 E-11), correspondiendo al primer M856 (8.5 E-10) como el que presenta la menor probabilidad, de discriminación.

Un locus es considerado polimórfico si se observan variaciones en la población para ese locus y si la frecuencia del alelo más común no supera 0.99 o 0.95. Cuando existen múltiples loci y cada locus se clasifica como polimórfico o no, se calcula el porcentaje de loci polimórfico, en el presente trabajo todas las zonas de muestreo fueron 100% polimórficas (Tabla 13), respecto a la diversidad genética las muestras del caserío de Conchor obtuvo el mayor valor con 0.4266 y Virú tuvo el valor más bajo con 0.399, valores relativamente altos o moderados en comparación con los obtenidos en otras investigaciones con ISSR para otras

especies, tal como sucede con la especie Ziziphus mistol diversidad genética para solo una

población analizada (0,167) (Tomas, 2017),similar también a la especie Ziziphus spina- christi (L.) con (0,154), en ambos casos corresponden a poblaciones aisladas, lo cual explica los resultados obtenidos.

La heterocigosis de un locus estima la probabilidad de que un individuo sea heterocigota para ese locus en la población, en el caso de los marcadores dominantes, se realiza una estimación insesgada basada en el valor esperado condicional de las frecuencias alélicas o heterocigosis esperada o insesgada de Nei (1978), los datos mostraron valores altos si consideramos que solo llegar a 0.5, indicando que se ha alcanzado un grado de diversidad máxima.

Con respecto al estadístico F de Wright es un análisis que permite evaluar el nivel o grado de diferenciación genética, este método estadístico es una herramienta muy útil para medir

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la variación genética dentro de poblaciones, y entre poblaciones; existen tres niveles de complejidad distintos en cuanto se evalúa a los organismos de manera individual (Fis), la evaluación de sub-poblaciones o poblaciones (Fst) y la evaluación de la población total (Fit); el índice de fijación (Fis) mide la consanguinidad de los individuos pertenecientes a una subpoblación o población de la cual forman parte, se le conoce también como coeficiente de consanguinidad, permitiendo medir la reducción de la heterocigocidad del individuo en base a la reproducción entre individuos emparentados que presentan un ancestro en común. El valor de Fis se puede interpretar como deficiencia o perdida de heterocigotos, si los valores obtenidos son positivos, esto podría ser consecuencia de consanguinidad, o una población de un tamaño reducido; por el contrario, si los valores son negativos, existe un exceso de individuos heterocigotos, el cual puede ser provocado diversos factores dentro de los cuales se encuentra, la migración, presencia de selección a favor de los individuos heterocigotos (Okumus, 2002). En los resultados obtenidos (Tabla 14), en los cinco marcadores ISSR podemos observar que presentan valores negativos para Fis, con un promedio de -1,752, lo cual indica exceso de heterocigotos, lo cual es positivo pues demuestra el grado de variabilidad individual presente en las poblaciones estudiadas, asi mismo indica la existencia de flujo génico entre las poblaciones; en el caso de Fst, el valor tiende a cero por lo tanto se puede asumir que la variación entre sub poblaciones es neutral, a comparación de la población total Fit (-1,750), donde si existe exceso de heterocigotos a

nivel poblacional; comparado con otras investigaciones en frutales como Mangifera indica,

donde los valores obtenidos para los estadísticos FIS y FIT fueron positivos para todos los marcadores revelando un déficit de heterocigotos, esto podría ser consecuencia de un alto nivel de endogamia en la población estudiada, siendo una de las consecuencias, la perdida de alelos y por lo tanto la pérdida de biodiversidad genética (Guerra et al, 2018).

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caseríos de Naubamba, Conchor, Coina Distrito de Usquil y de la parcela demostrativa de San Carlos (Chavimochic) en el distrito de Chao, provincia de Virú (Tabla 15; Figura30), se puede indicar que existe similaridad entre las muestras correspondientes a los caseríos de Naubamba y Conchor (0,74), correspondiendo al menor valor de similaridad a las muestras provenientes de Coina y Naubamba (0,94), siendo llamativo el hecho de que las diferencias genéticas existentes se dan entre las poblaciones rusticas o nativas cuando se esperaba que fuera la muestra de Chao (Virú), la que se diferencie respecto a las demás muestras o caseríos, por corresponder a una variedad cultivada o de seda, respecto a las muestras de los caseríos que corresponden a lucuma de palo y son más rusticas; sin embargo, los marcadores ISSR, indican mayor diferenciación genética intrapoblacional que entre poblaciones. Respecto a las muestras amplificadas para código de barras de ADN, en la gran mayoría de las muestras la amplificación con ambos marcadores funcionó perfectamente lo cual se demuestra en las imágenes de los geles de agarosa utilizados para este proceso (Figuras.31- 38), de todas las muestras amplificadas se seleccionaron cinco por zona para el proceso de secuenciación, se decidió escoger genes cloroplasticos por algunas características como por que el ADNcp es el genoma circular encontrado en plantas posee herencia materna y ausencia de recombinación. No obstante, presenta una tasa mutacional más lenta (es más conservado) respecto al genoma mitocondrial. Una parte del ADNcp (alrededor de 1400 pares de bases nucleotídicas) la constituye el gen que codifica para la subunidad mayor de la enzima Ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (rbcL) utilizada para resolver filogenias a diferentes clases taxonómicas (Suarez, 2019).

Con respecto al gen MatK, es considerado un gen putativo del grupo de intrones tipo II que codifica para la proteína madurasa, la cual participa en la regulación del desarrollo de las plantas y funciona como un “regulador genético” que limita su evolución. Ello explica la relativamente baja variación intra-específica pero alta a nivel inter-específico, esto podría

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sustentar el hecho de que ninguna de las dos regiones permitió diferenciar o evidenciar variaciones en las muestras provenientes de las poblaciones silvestres o rusticas con respecto a la población comercial para el gen MatK (Figura 39 y 40) y para el gen RbcL (Figura 41 y 42), observándose distancias muy pequeñas entre las diversas muestras procesadas con el método de Kimura de 2 parametros.

Las secuencias de ADN obtenidas fueron sometidas a un alineamiento en la página de BOLD System, para solicitar que Bold nos indique la especie, utilizando la información presentes en su base de datos, dando como resultado el alineamiento de 20 secuencias (5 Naubamba, 5 Conchor, 5 Coina y 5 Virú) en la base de dato BOLDSYSTEMS, para el marcador MatK, dando como resultados, distintas especies correspondientes al mismo género (Pouteria) de la lúcuma; algo similar ocurrió con las muestras correspondientes al gen RbcL, en el cual a diferencia del marcadores antes mencionadas el resultado de BOLD, fue la identificación de

todas las muestras como correspondientes como pertenecientes a Niemeyera antiloga, esto

se debe a que en la base de datos de Bold System no existe registro de Pouteria lucuma, lo

cual haría necesario seguir el proceso de ingresar la secuencias obtenidas como resultado de la presente tesis a esta importante bases de datos, y puedan servir de referencias a futuras investigaciones.

Finalmente cabe resaltar que recientemente se ha realizado una tesis para obtener el grado de doctor Agricultura sustentable de la Universidad Agraria La Molina, donde analizan la

variación morfológica y molecular en P. lucuma, destacando moderada o baja variabilidad

genética de las poblaciones colectadas, probablemente por tratarse de colectas en huertas familiares, a diferencia de la presente investigación donde evaluamos poblaciones de P. lucuma de zonas alejadas de la provincia de Otuzco, observándose de forma preliminar resultados que demuestran variabilidad genética en las poblaciones muestreadas; pudiendo considerarse a futuro a estas poblaciones para programas de selección de plantas resistentes

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a enfermedades y producción, enmarcado en un programa de mejoramiento genético, tal como se sugiere en la investigación (Borbor, 2017).

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