Las micobacterias tienen como característica importante la abundancia de lípidos en su pared celular. Entre los lípidos micobacterianos más estudiados por su valor taxonómico se destacan los ácidos micólicos y otros ácidos grasos de la pared celular. Estos ácidos micólicos pueden separarse con relativa facilidad en su forma de ésteres metílicos.
Se pueden separar grupos de micobacterias por cromatografía de capa fina e identificarse por cromatografía de gases, también, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cromatografía de gases/espectrometría de masas (5,34). El estudio de los ácidos micólicos mediante HPLC ha demostrado ser rápido, reproducible, específico de especie y de aplicación universal en la identificación micobacteriana. No obstante, al igual que el resto de técnicas cromatografícas, no deja de ser un método complejo que requiere una infraestructura costosa y un gran entrenamiento, constituyendo una alternativa útil de identificación sólo en aquellos centros con la dotación y experiencia suficientes recursos (12, 20 40, 44,). La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija y otra móvil. En cromatografía gaseosa, la fase móvil es un gas que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. Esta fase fija puede ser un sólido poroso (cromatografía gas-sólido o CGS), o bien una película líquida delgada que recubre un sólido particulado o las paredes de la columna (cromatografía gas-líquido o CGL). En el primer caso, el proceso que produce la separación es la adsorción de los componentes de la mezcla sobre la superficie sólida y en el segundo, la partición de los mismos entre las fases líquida y gaseosa (1, 43, 49,111).
La cromatografía por capa fina emplea placas de silica (fase estacionaria) y sobre la superficie de esta se colocan los ácidos micolicos extraídos a la micobacteria y estos son separados como consecuencia de su afinidad por un solvente (la fase móvil). Una vez que la placa ha sido separado, cada especie muestra un modelo particular de punto según el ácido micolico contenido el cual puede ser identificado por la comparación con el patrón de referencia.(88,98).
Figura 11. Cromatografía por capa fina para detección de ácidos micolicos. PALOMINO, Juan Carlos, Cardozo silvia,Ritacco Viviana. Tuberculosis 2007, From Basic Science to patient care. Brazil 2007.
El alto número de especies de micobacterias ha reducido considerablemente la importancia de la cromatografía por capa fina para la identificación en el nivel de especie ya que solo se presentan sólo siete tipos de ácidos micolicos para la cantidad de micobacterias que existen.
7.5.2.1 Cromatografía Gas- Líquido (GLC)
El sistema GLC trata de un gas que contiene la muestra y atraviesa una columna rellena de líquido. A la entrada de la columna se colocan los lípidos que son previamente extraídos de la micobacteria (en estado gaseoso), éstos serán arrastrados por el gas, dependiendo de su coeficiente de reparto irán quedando más o menos tiempo en el líquido, lo que provoca la separación de los lípidos convirtiéndolos en esteres de metilo saturados con 22,24 y 26 átomos de carbono después de cierto tiempo (20).
Figura 12. Algoritmo que refleja el manejo de las muestra de esputo. KONEMAN, Elmer William, et al. Diagnóstico microbiológico texto y atlas color. 6a ed. Buenos Aires ; Bogotá : Editorial Médica Panamericana, 2006
7.5.2.2 Cromatografía por capa fina (CGS)
Los fragmentos de ácidos micolicos, ácidos grasos saturados e insaturados (incluyendo el ácido tuberculoestearico) y alcoholes son eluidos, saliendo antes aquel que halla permanecido más tiempo en la fase móvil. El reconocimiento de diferentes productos de elución por lo general es obtenido por la espectofometría de masas. Los productos clivados, que son invariados contienen un solo tipo de ácidos micolicos, junto con ácidos grasos y alcoholes presentan un modelo
constante para la especie y el cual es conveniente para su diferenciación. El detector colocado al final de la columna envía una señal que se refleja en forma
de picos, cada uno correspondiente a un componente de la muestra. El primer pico que aparece se denomina pico del aire y corresponde a la detección de una cantidad muy pequeña de aire que entra a la columna cuando se introduce la muestra en el cromatógrafo. En muchas ocasiones se toma como punto de referencia. La línea base es la parte del registro que corresponde al gas portador puro, sin compuesto(20).
Figura 13. Modelo de GLC para M. avium. PALOMINO, Juan Carlos, Cardozo silvia,Ritacco Viviana. Tuberculosis 2007, From Basic Science to patient care. Brazil 2007.
7.5.2.3 Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
En la actualidad HPLC es considerado el único método fenotípico conveniente para diferenciar casi todas las especies de micobacterias por lo tanto es una de la técnicas más importantes (104).
En el sistema HPLC el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se considera una propiedad característica de un compuesto en una determinada fase móvil y estacionaria. (118, 119,122).
La utilización de presión en este tipo de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos.
Los resultados son dados basados en la absorbancia ultravioleta de cada muestra, el detector traza fracciones solas como picos arreglados en un perfil.
El perfil de cada especie es suficientemente diferente de otra especie (ver figura 16) la identificación es proporcionada cuando visualmente es comparada con perfiles ya conocidos de otras micobacteria (118, 119,122). Un sistema de detección a base de fluorescencia también puede ser usado pero es más sensible que el sistema ultravioleta (118, 119,122).
Desde hace mucho tiempo, la identificación por HPLC ha Sin embargo, el número de especies es apenas diferenciable y no distinguible en absoluto, debido a que ha aumentado, la descripción continua de nuevas especies, yal rápido crecimiento en cultivos (118, 119,122).
Figura 14. Modelo representativo de HPLC. A, M. tuberculosis complex, B, M. intracellulare; C, M. gordonae; D, M. chelonae; E, M. simiae; F, M. nonchromogenicum. PALOMINO, Juan Carlos, Cardozo silvia,Ritacco Viviana. Tuberculosis 2007, From Basic Science to patient care. Brazil 2007.