Se tomó un camarón del estanque 6 y se extrajo el hepatopáncreas, se colocó en 500 µl de agua de mar estéril, se homogenizó manualmente con pistilo y con vórtex. Del homogenizado se inocularon 50 µl en cajas con medio sólido y 200 µl en 3 ml de medio líquido, para lo cual se utilizó medio F/2 (Guillard, 1962)
(Anexo 4). Los cultivos sólidos y líquidos se pusieron a crecer en fotoperíodo (12 horas luz-12 horas oscuridad) a una intensidad de 30 µEm-2s-1 y un intervalo de temperatura entre 20-30 °C, donde permanecieron alrededor de 3 a 4 semanas. Las cajas inoculadas se observaron cada semana en el microscopio estereoscópico y los cultivos en líquido fueron analizados al microscopio óptico (olympus BX60), para de esta forma monitorear el crecimiento de las cianobacterias (Torres-Ariño, 2001).
Una vez crecidas las cianobacterias se prosiguió con el aislamiento de las especies, para lo que se probaron diferentes métodos según Rippka (1988) los cuales fueron:
Método de fototactismo: se colocó una muestra de cianobacterias en el centro de la placa con agar y se cubrió con papel oscuro, dejando un espacio por donde llegara la luz con el objetivo de separar las cianobacterias, ya que estas desarrollan sus filamentos hacia la fuente de luz.
Los filamentos mas separados del inóculo se tomaron cortando el agar de alrededor con una navaja estéril y colocándola en otra placa con medio fresco, de tal modo que la muestra quedara en contacto directo con el agar, llamándose a este el método del bloque invertido.
Separados los filamentos se tomó una muestra, se colocó en 3 ml de medio líquido y en fotoperiódo (12 horas luz-12 horas oscuridad) por alrededor de 3 semanas, con el objetivo de obtener cultivos unicianobacterianos.
V.1. Caracterización morfológica.
Una vez aisladas las cianobacterias se siguió con la identificación morfológica con apoyo de la Dra. Elizabeth Ponce (comunicación personal), quién trabaja en esta línea de investigación. Para esto se tomaron muestra de los filamentos y se colocaron en portaobjetos, observándose a través del microscopio óptico en campo claro y contraste de fase.
V.2. Caracterización molecular.
Para la identificación molecular de las cianobacterias se llevo a cabo el siguiente procedimiento: extracción de DNA cromosomal, amplificación por PCR de una región variable del gene que codifica para el 16S rRNA, el producto obtenido se purificó para ser secuenciado y a la vez sometido a digestión con la enzima de restricción Hha I que reconoce 4 nucleótidos, y poder comparar los patrones de restricción con los obtenidos por Lagunas (2003).
V.2.1. Extracción de DNA cromosomal
Se purificó el DNA cromosomal de las cianobacterias aisladas, así como del tejido donde se aisló (hepatopáncreas, estanque 6 segundo muestreo), utilizando la metodología reportada por Golden (1988) y modificada por Lagunas (2003), la cual consiste en romper las células o filamentos por sonicación, seguido de un tratamiento con lisozima, detergente y proteinasa K, para asegurar el rompimiento
de las células. Para la extracción sé siguió el método tradicional con disolventes como el fenol, cloroformo y alcohol isoamílico, para mayor detalle ver anexo 5.
Una vez realizada la extracción del DNA, se prosiguió con el análisis cuantitativo y cualitativo, como ya se menciono anteriormente en el apartado IV
V.2.2 Amplificación por PCR de los ITS
Para la amplificación de la región intergénica (ITS) de las cianobacterias se utilizaron los oligonucleótidos: cianol16sfinfor con la secuencia CTGGGGTGAAGTCGTAACAAG (Torres-Ariño, 2001) que híbrida en la parte final del gene 16S rDNA y el oligonucleótido ARNr 23S-ciano con la secuencia 5’GCTCTGTGTGCCTAGGTATC3’, el cual híbrida con la parte inicial del gene 23S rDNA de cianobacterias (Wilmotte et al., 1993), con los cuales se esperaba un producto de entre 400 y 600 pb.
La reacción de amplificación se realizó con base a las instrucciones del Kit para PCR marca invitrogen. Preparando en tubos Eppendorf de 0.5 las siguientes mezclas de reacción: 5 µl de solución amortiguadora (buffer 10X), 1 µl de la mezcla de desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1.5 µl (1.5 mM) de cloruro de magnesio, 1 µl del iniciador (5’), 1 µl del iniciador (3’), 2 µl de ADN (1 µg/µl), 38.25 µl de agua y 0.25 µl de enzima TaqDNA .
Las muestras se colocaron inmediatamente en un termociclador Gene E (Techne). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo de acuerdo a las condiciones que se muestran en la tabla V.
Tabla V. Programa de tiempos y temperaturas de amplificación por PCR
Programa Tº/t Ciclos
Desnaturalización inicial 95ºC, 5 min 1
Desnaturalización Alineación Extensión 95ºC, 1 min 65ºC, 1 min 72ºC, 1 min 35
Extensión final 72ºC, 10 min 1
Los productos obtenidos se analizaron en un gel de agarosa al 1.2 %.
V.2.3. Patrones de restricción de cianobacterias (RFLP)
Los productos amplificados de la región intergénica se digirieron con la enzima de restricción HhaI, la cual fue seleccionada basándose en un trabajo realizado en el laboratorio de biología molecular en CICESE (Laguna, 2003), donde identificaron cianobacterias del mismo sitio, basándose en análisis morfológicos y moleculares, teniendo patrones ya establecidos para cada una de las especies ya identificadas, sirviendo como patrón de comparación.
La reacción de digestión se preparó con 5 µl del producto de PCR, 1 µl de buffer 4Ne por cada 10 µl del volumen total de la reacción (3 µl), 1 µl de la enzima
HhaI, llevando aun volumen final de 30 µl con 21 µl de agua mQ. Se mezcló y sé centrífugo rápidamente en la microcentrifuga y se colocó en un baño de agua a 37 ºC por 3 h, el tubo fue sellado con parafilm y tapa de seguridad para mantener las condiciones dentro del tubo.
Las muestras digeridas se analizaron en geles de acrilamida al 7.5 %, teñidos con Bromuro de Etidio (Anexo 6) Esto debido a la baja resolución de las bandas de bajo peso molecular en geles de agarosa.
V.2.4. Secuenciación.
Además, de los RFLP se amplifico el gene 16S rRNA, con el objetivo de identificar la especie aislada. Utilizando el oligonucleótido universal Bseg (Hernández y Olmos, en proceso) y el oligonucleótido especifico ARN 23S-ciano (Wilmotte et al., 1993). El producto de PCR se purificó (Anexo 7) y se envió a secuenciar.