ANNEX IV: PROGRESS IN OTHER PROGRAMMES
EDF 9 Projects and Programmes outside focal sectors
es que las membranas citoplásmicas son más delgadas que la membrana plasmática: su espesor es de unos 7 nm, frente a los 10 nm de la membrana plasmática. El espesor de la bicapa lipídica es también menor: 4 nm en las membranas citoplásmicas y 5 nm en la membrana plasmática. Además, las membranas citoplásmicas tie- nen, en general, mayor proporción de proteínas que la plasmática. Esto último es muy evidente en las membra- nas mitocondriales que conservan su estructura al elimi- nar los lípidos.
Por otra parte, esta estructura trilaminar no está tan clara en algunas membranas citoplásmicas, particular- mente en el caso de las mitocondrias, cuya membrana muestra partículas globulares, sobre todo cuando se utilizan determinados fijadores. Esto llevó a algunos in- vestigadores de la década de 1960-70 a proponer dife- rentes modelos, en los que los lípidos de la membrana se disponían radialmente formando glóbulos, con los grupos polares hacia el exterior (Fig. 2.1.C). Al mismo tiempo, en estos modelos se discutía la disposición de las proteínas, que se distribuirían por toda la membrana (Figs. 2.1.C. y 2.1.D).
EL MOSAICO FLUIDO DE MEMBRANA.
ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN
Hacia 1970 se produjeron grandes avances en la bús- queda de un modelo de membrana debido al desarrollodel concepto termodinámico de interacciones hidrófo- bas e hidrófilas entre moléculas, enlaces no covalentes como puentes de hidrógeno, e interacciones electrostá- ticas. Se llegó a la conclusión de que las proteínas (que también tienen grupos polares y no polares) no podían disponerse en configuración beta, como se postulaba en el modelo de Danielli y Davson, sino de modo que, como ocurre en los lípidos, sus grupos polares estén en contacto con la fase acuosa y los no polares queden en el interior de la membrana.
Por lo que respecta a las técnicas de microscopía electrónica, las dos siguientes fueron de un gran valor en el estudio de las membranas:
1. Contraste negativo, que permitió observar protu- berancias e irregularidades en las membranas, imposibles de apreciar en los cortes. En algunas células se vio que la membrana plasmática está constituida por bloques o unidades poligonales. 2. Criofractura-réplica. Al romperse las membranas por las líneas de mínima resistencia, éstas quedan divididas en dos hemimembranas: P (protoplásmi- ca o interna) y E (exoplásmica o externa). La super- ficie interna de cada hemimembrana no es lisa, y sobre ella resaltan partículas de 4 a 16 nm sobre un fondo liso. Estas partículas se corresponden con cavidades en el fragmento complementario de la membrana y son debidas a proteínas, por lo que son más abundantes en membranas ricas en enzi- mas. Las dos partes de la membrana son asimétri-
Figura 2.3. Muestra obtenida por criofractura-réplica de la membrana plasmática. El plano de fractura divide a ésta en dos hemimembranas que presentan una estructura asimétrica. La hemimembrana señalada como I (P) es la interna o protoplásmi- ca; la señalada como E es la externa o exoplásmica. Sobre la hemimembrana interna se observan partículas de mayor tamaño que las que aparecen sobre la externa, la cual presenta cavidades en las que encajan las partículas que sobresalen en la hemi- membrana protoplásmica. X90 000. (Tomado de Fawcett DW. A Textbook of Histology, 11.ª ed. Philadelphia, Saunders, 1986.)
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contacto con la fase acuosa. Forman la matriz de la membrana. Hay unos cinco millones de moléculas lipí- dicas por
µ
m2de membrana.Los principales tipos de lípidos que forman ambas bicapas de la membrana son los siguientes (Fig. 2.6):
1. Las grasas neutras, formadas por ésteres de gli- cerol y uno (monoglicéridos), dos (diglicéridos) o tres (triglicéridos) ácidos grasos, son un compo- nente minoritario, o incluso ausente, en la mem- brana plasmática. En las membranas de bacterias y células vegetales son frecuentes los glucolípidos simples, constituidos por glicerol esterificado con uno o dos ácidos grasos y con un monosacárido o un oligosacárido unido al tercer hidroxilo.
2. Fosfolípidos. Son fosfodiglicéridos, es decir, con- sisten en una molécula de glicerol esterificado con dos ácidos grasos (de 16 y 20 carbonos de longitud); cada uno de ellos se encuentra unido por su extremo carboxilo a un hidroxilo del glice- rol. El tercer hidroxilo del glicerol está esterificado con un fosfato. Si este fosfato no se esterifica con ningún otro componente, el fosfolípido se deno- mina ácido fosfatídico. Si el fosfato se une a otros radicales, se denomina de acuerdo con este radi- cal. Los principales fosfolípidos son los unidos a colina (fosfatidil colina o lecitina), serina (fosfatidil serina o cefalina), etanolamina (fosfatidil etanola- mina, también denominada cefalina, como el fos- folípido anterior), inositol (fosfatidil inositol), o a otra molécula de glicerol (fosfatidil glicerol). En las membranas también hay otro fosfolípido, for- mado por la unión de dos ácidos fosfatídicos a otra molécula de glicerol (difosfatidil glicerol o cardiolipina).
3. Esfingolípidos. Son derivados de la esfingosina, que es un aminodialcohol con un largo hidrocar- cas, siendo las partículas más abundantes y mayo-
res en la hemimembrana P (Fig. 2.3).
Con los resultados de estos y otros estudios, Singer y Nicolson (1972) llegaron a proponer un modelo que ha sustituido a todos los anteriores y que, pese al tiempo transcurrido, se encuentra en vigor y se aplica a todas las membranas de la célula. Es el modelo del mosaico fluido de membrana (Figs. 2.4 y 2.5), en el que las proteínas, lí- pidos e hidratos de carbono se sitúan en una configura- ción estable de baja energía libre. Los lípidos forman una bicapa en la que se disponen las proteínas configuradas de acuerdo con las interacciones que establecen con las moléculas que las rodean. Hay también oligosacáridos que se disponen sobre los lípidos y las proteínas en la hemimembrana E.
La membrana plasmática del eritrocito de rata tiene un 60% de proteínas y un 40% de lípidos. Esta proporción es similar a la encontrada en las membranas plasmáticas de la mayoría de los tipos celulares; por ejemplo, la membrana plasmática del hepatocito de rata tiene un 58% de proteínas y un 42% de lípidos. No obstante, exis- ten membranas plasmáticas que se alejan mucho de esta proporción, como la mielina, que tiene un 20% de proteí- nas y un 80% de lípidos.
Las membranas citoplásmicas, además de ser más delgadas que la plasmática, como ya se ha dicho, po- seen mayor proporción proteínas/lípidos. La diferencia más notable radica en la membrana mitocondrial inter- na, que tiene un 80% de proteínas y un 20% de lípidos. La Tabla 2.1 muestra la composición de diferentes mem- branas celulares.
LÍPIDOS DE LAS MEMBRANAS
Los lípidos forman una doble capa, con los grupos hi- drófobos en el centro y los hidrófilos en el exterior, en
Oligosacáridos (glicocálix) Superficie externa Hemimembrana externa (cara E) Monocapa lipídica Proteína integral Hemimembrana interna (cara P) Proteína integral transmembranosa Citoplasma Figura 2.4. Representación tridimensional del modelo
del mosaico fluido de mem-
brana. La membrana se ha
separado parcialmente en dos hemimembranas, como que- da tras el tratamiento de crio- fractura-réplica.
CAPÍTULO2: MEMBRANA PLASMÁTICA Y MEMBRANAS CITOPLÁSMICAS
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Oligosacárido unido a un lípido Oligosacárido unido a una proteínaProteína periférica unida a un oligosacárido Lípido Proteína integral trasmembranosa CARA E CARA P Proteína integral parcialmente embebida Proteína periférica
unida a una proteína integral
Proteína periférica unida a un lípido
Figura 2.5. Modelo de membrana plasmática basado en el modelo del mosaico fluidopropuesto por Singer y Nicolson. Las proteínas integrales aparecen embebidas en la bicapa lipídica formando hélices de uno o varios pasos. La mayoría de ellas atraviesan totalmente la membrana (proteínas transmembranosas); otras sólo ocupan una hemimembrana. Las proteínas pe- riféricas están adosadas a una hemimembrana, uniéndose a una proteína integral, a un lípido o a un oligosacárido que, a su vez, está unido a un lípido. Los oligosacáridos quedan sobre la hemimembrana externa y forman el glicocálix; pueden estar unidos a una proteína integral o a un lípido.
TABLA2.1. Diferencias en la composición de lípidos (%) entre diferentes tipos de membranas celulares en el hígado de rata
MP: membrana plasmática. RER: retículo endoplasmático rugoso. REL: retículo endoplasmático liso. EN: envoltura nuclear. Gol: complejo de Gol- gi. Lis: lisosoma. Mi ex: menbrana mitocondrial externa. Mi in: menbrana mitocondrial interna: eritrocito; hep: hepatocito.
MP MP RER REL EN Gol Lis Mi ex Mi in eritr hep hep hep hep hep hep hep hep Proteínas 60 58 70 70 70 65 70 60 80 Lípidos totales 40 42 30 30 30 35 30 40 20 Ácido fosfatídico 1 1 1 Fosfatidil colina 31 24 55 54 55 49 33 47 44 Fosfatidil etanolamina 15 11 19 19 20 15 13 23 24 Fosfatidil serina 7 9 3 1 3 4 5 2 1 Fosfatidil inositol 2 4 8 7 7 6 7 11 6 Fosfatidil glicerol 2 4
Cardiolipina (difosfatidil glicerol) 3 16 Ceramida y esfingomielina 13 14 3 6 3 10 20 5 3 Glucolípidos 3 7
Colesterol 24 25 9 12 10 14 18 5 3
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Glicerol Ácido graso
Monosacárido
Ácido siálico Galactosamina Galactosa PO4 Cadena alifática Gangliósido Glucolípidos simples Colesterol PO4 Fosfatidil colina Fosfatidil glicerol Difosfatidil glicerol Fosfatidil inositol PO4 Fosfatidil etanolamina PO4 Fosfatidil serina PO4 PO4 PO4 Esfingosina Ceramida PO4 Esfingomielina Cerebrósido PO4 Ácido fosfatídico CH OH - CH - N - (CH2 2 3)3 CH OH- CHOH - CH OH2 2 CH - CH - CH - ... - COOH3 Grasas neutras Colina Inositol OH H OH OH OH OH OH H H H H H CH OH - CHNH - COOH2 2 Serina Colina Inositol CH OH - CH - NH2 2 2 Etanolamina Serina Etanolamina
Glicerol Glicerol Glicerol
Glicerol Glicerol Glicerol Glicerol Glicerol Glicerol Glicerol Glicerol Glicerol CH OH - CHNH - CHOH - CH = CH - (CH2 2 2 12) - CH Esfingosina Esfingosina Esfingosina Monosacárido Colina Galactosa Glucosa Esfingosina OH CH3 CH3
Figura 2.6. Representación esquemática de la composición de los lípidos de la membrana plasmática.
CAPÍTULO2: MEMBRANA PLASMÁTICA Y MEMBRANAS CITOPLÁSMICAS
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buro terminal. La esfingosina unida a un ácido gra- so en su grupo amino forma la ceramida.
— La ceramida esterificada con fosfato y colina en el grupo hidroxilo terminal forma la esfin- gomielina. Debido a la presencia del fosfato y colina, se puede incluir entre los fosfolípidos. — La ceramida unida a hidratos de carbono (de uno
a 15 azúcares) forma glucolípidos complejos (glu- coesfingolípidos), abundantes en las membranas de células animales. Éstos pueden ser:
• Cerebrósidos. El hidrato de carbono es un monosacárido. En la mielina abunda el galac- tocerebrósido, que sólo tiene galactosa. • Gangliósidos. El hidrato de carbono es un oli-
gosacárido con varios residuos de ácido siáli- co (N-acetil neuramínico), que le confiere car- ga negativa.
4. Esteroles derivados del ciclopentano-perhidro-fe- nantreno, con un hidroxilo en un extremo y una cadena alifática corta en el otro. El más común es el colesterol.
Entre los diferentes modelos experimentales de mem- brana utilizados para investigar las propiedades de la bi- capa lipídica se encuentran los liposomas, constituidos por bicapas lipídicas en forma de esfera de 25 nm a 1
µ
m de diámetro, y las membranas negras, que son bicapas lipídicas planas formadas en un agujero situado en la separación entre dos compartimientos acuosos. Estos estudios han llevado a precisar que las membranas fun- cionales requieren una matriz lipídica fluida; esto es, una membrana es funcional cuando se mantiene por encima del punto de fusión de sus lípidos. La tempera- tura de fusión depende de la longitud de la cadena de los fosfolípidos, del número de dobles enlaces y de la concentración de colesterol.En esta matriz fluida, los lípidos pueden hacer despla- zamientos de difusión lateral, rotación y flexión con una constante de difusión lateral de 10–8cm2/s. En contraste con estos movimientos laterales, son infrecuentes los movimientos de voltereta (flip-flop), esto es, inversión de la polaridad de las moléculas cruzando la membrana de arriba a abajo. Sólo son frecuentes durante la síntesis de membrana por el retículo endoplasmático (véase pá- gina 49).
La permeabilidad de la membrana disminuye con la abundancia de colesterol, que presenta los siguientes efectos: (a) dificulta que las cadenas de hidrocarburos de los ácidos grasos se junten y cristalicen; (b) dificulta la permeabilidad de la membrana para las pequeñas moléculas solubles; y (c) aumenta la flexibilidad y la es- tabilidad mecánica de la bicapa.
Existe asimetría en la bicapa lipídica, pues hay ma- yor proporción de fosfatidil colina y esfingomielina (fosfolípidos con colina y que poseen ácidos grasos saturados) en la hemimembrana exoplásmica (E), y mayor cantidad de fosfatidil etanolamina y fosfatidil serina (fosfolípidos con ácidos grasos insaturados) en la hemimembrana citoplásmica (P). La matriz lipídica de la hemimembrana P es más fluida que la de la E de-
bido a su mayor contenido en ácidos grasos insatura- dos. La mayor presencia de fosfatidil serina (con fuerte carga negativa) en la hemimembrana P determina que exista una diferencia de carga entre ambas hemimem- branas. De las causas de esta asimetría se tratará en página 49.
PROTEÍNAS DE LAS MEMBRANAS
Proteínas integrales y periféricas
De acuerdo con configuración que adoptan en la mem- brana, las proteínas son de dos tipos (véase Fig. 2.5):
Proteínas integrales
Estas proteínas suelen atravesar por completo la mem- brana (proteínas transmembranosas) formando hélices
α
de paso único o múltiple por la membrana, aunque se conocen algunas que sólo ocupan una hemimembrana, como el citocromo b5del retículo endoplasmático. Sonanfipáticas, es decir, presentan una distribución asimé- trica de los grupos hidrófilos e hidrófobos, lo que las ca- pacita para estar en parte embebidas y en parte sobre- salientes en la membrana. La extensión en que una proteína integral está embebida se regula por el equili- brio termodinámico; esto es, está determinada por la secuencia de aminoácidos y la estructura covalente de la molécula, así como por su interacción con las molé- culas que la rodean. Los grupos polares de la proteína quedan generalmente en la superficie de la membrana, mientras que los residuos no polares permanecen em- bebidos entre las cadenas hidrocarbonadas de los fos- folípidos.
Las proteínas integrales están firmemente unidas a los lípidos por interacciones hidrófobas. Algunas refuer- zan la unión por enlaces covalentes con lípidos y sólo se disocian de éstos por tratamientos drásticos (deter- gentes, agentes que desnaturalizan las proteínas y di- solventes orgánicos) que destruyen la integridad de las membranas.
Las proteínas integrales pueden realizar movimien- tos de rotación y de traslación con una constante de di- fusión de aproximadamente 5
×
10–9cm2/s. El desplaza- miento de las proteínas se mostró con el siguiente experimento. Se cultivaron conjuntamente células de ratón y células humanas y se marcó una proteína espe- cífica de la membrana plasmática de la célula de ratón mediante un anticuerpo unido a un colorante fluores- cente. Se hizo lo mismo con otra proteína específica de la membrana de la célula humana, pero marcando ésta con un colorante diferente para distinguir ambas proteí- nas. Tras fusionar ambas células, se vio que, al princi- pio, cada tipo de proteína quedaba limitada a un área diferente en la célula híbrida, pero posteriormente am- bas proteínas se entremezclaban (Fig. 2.7). Durante estos movimientos las proteínas son capaces de mante- ner su orientación molecular y su grado de intercalación en la membrana, como resultado de su estructura anfi- pática.BIOLOGÍA CELULAR
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pueden obtenerse: basta con provocar la lisis de esta célula, en un medio hipotónico. Estas proteínas compren- den (Fig. 2.8):
1. La glucoforina. Es una glucoproteína de unos 30 ki- lodaltons (kDa), cuya porción transmembranosa tiene la forma de una hélice
α
de paso único. El segmento externo está muy glucosilado, con oli- gosacáridos que están unidos a oxígeno o a ni- trógeno y constituyen hasta un 64% del peso de la proteína. Estos oligosacáridos constituyen casi la totalidad de los hidratos de carbono de la membrana del eritrocito; predomina (hasta el 90%) el ácido siálico, que tiene fuerte carga ne- gativa.2. La proteína banda 3. Es también transmembrano- sa y está formada por dos monómeros de 100 kDa (929 aminoácidos) cada uno, que forman múlti- ples hélices
α
transmembrana (unos 14 segmen- tos) y proporcionan un canal hidrófilo para el pa- so de Cl– y CO3H–. En su cara externa presentaalgunos oligosacáridos unidos a nitrógeno. Se dis- pone formando tetrámeros (dos dímeros) y es cru- cial en el paso del CO2de la sangre al interior del
eritrocito.
3. La anquirina o proteína banda 2.1, de 210 kDa. Co- necta cada dímero banda 3 a una proteína esque- lética llamada espectrina.
4. Las proteínas esqueléticas espectrina, actina y tropomiosina, situadas bajo la membrana plas- mática, y las proteínas banda 4.1 y aducina, que se encuentran asociadas a las anteriores. La es- pectrina supone el 25% de las proteínas de esta membrana. Es una molécula larga, delgada y fle- xible, constituida por dos monómeros alargados (
α
de 240 kDa yβ
de 220 kDa) que se disponen formando una doble hélice de unos 100 nm de longitud y unos 5 nm de espesor. A su vez, dos El movimiento de desplazamiento de las proteínaspuede abrir poros transitorios o dinámicos. De esta ma- nera, el paso a través de la membrana del agua y de sustancias insolubles en lípidos no requiere la presen- cia de poros, que nunca se han visto. Además, algunas proteínas actúan como moléculas portadoras uniéndo- se a las sustancias transportadas. Son proteínas trans- membranosas que poseen actividades tipo permeasa, y en su interior existen caminos polares para permitir el transporte molecular. De estos aspectos se tratará más adelante en este mismo capítulo (véase página 53).
Proteínas periféricas
Estas proteínas no son transmembranosas y sobresalen en una de ambas hemimembranas (véase Fig. 2.5). Es- tán asociadas a la membrana únicamente por un enlace covalente con un ácido graso o por interacciones no co- valentes (principalmente electrostáticas) con una pro- teína integral. No están estrechamente asociadas a los lípidos, y un tratamiento con la adición de un agente quelante (tratamiento de tipo suave), basta para diso- ciarlas enteras de la membrana. Se encuentran sobre todo en la hemimembrana P y corresponden en su ma- yor parte a enzimas.
En la hemimembrana E son muy escasas y pueden unirse a una molécula de GPI (glucosilfosfatidil inosi- tol), esto es, a un oligosacárido que, a su vez, se en- cuentra unido a los dos ácidos grasos de una molécula de fosfatidil inositol.
Algunas proteínas específicas de la membrana
plasmática
Las proteínas de la membrana plasmática más estudia- das son las del eritrocito, debido a la facilidad con que
Proteína específica de membrana de la célula de ratón marcada
Célula de ratón Proteína específica de membrana de la célula humana marcada Célula humana Célula híbrida producida por fusión
Célula híbrida después de un cierto tiempo
Figura 2.7. Demostración del desplazamiento de las proteínas por la membrana plasmática. Cada una de las dos células en cultivo pre- senta una proteína diferente marcada, utilizando dos co- lorantes diferentes para que se distingan. Al fusionar am- bas células, en la célula hí- brida resultante se observan las dos proteínas, al princi- pio en áreas diferentes; des- pués, al mantener un tiempo el cultivo a 37 °C, ambas pro- teínas se entremezclan.
CAPÍTULO2: MEMBRANA PLASMÁTICA Y MEMBRANAS CITOPLÁSMICAS
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dímeros se asocian en sentido longitudinal y opuesto, estableciendo contacto por sus cabe- zas, para formar tetrámeros. A este contacto se ancla la espectrina en la membrana mediante la proteína anquirina, la cual, como se ha dicho, se ancla a su vez en el dímero banda 3. Los tetráme- ros de espectrina forman una red bajo la mem-