fenol/cloroformo. En el caso de que los fragmentos fueran pequeños (>300 nts),
o se necesitara obtener una gran cantidad de ADN, éstos eran purificados
mediante electroelución. Esta técnica consiste en separar los fragmentos de
restricción en un gel de agarosa y cortar el pedazo de agarosa en el que se
encuentra el fragmento a purificar. El bloque de agarosa con el fragmento de
ADN se introduce en una membrana de diálisis de poro inferior a 25 Å con 100 µl
de tampón TBE 0,5 X. Esta membrana se coloca en una cubeta de electroforesis
que contiene TBE 0,5 X para que el ADN salga de la agarosa y se quede en el
tampón que hay dentro de la membrana. Se separa durante 30‐40 min a 100 V y
después se da la vuelta a la membrana y se separa durante 10 seg para que el
ADN que se ha quedado pegado en la parte de la membrana más cercana al
cátodo, se despegue. El contenido se recoge con una pipeta y se precipita el ADN
con fenol/cloroformo.
1.2. ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN
Las digestiones de ADN con enzimas de restricción se realizaron poniendo 1
µl de enzima (MM3) y 500‐800 ng de ADN en un volumen de reacción total de 20
l. Para las digestiones dobles se eligieron tampones de reacción en los que
ambos enzimas presentaban el máximo porcentaje de corte. Las reacciones de
digestión se incubaron en un baño a 37oC durante un mínimo de 2 h. Los
resultados de las digestiones se analizaron mediante electroforesis en gel de
agarosa.
1.3. AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
La amplificación se llevó a cabo mediante RCP empleando diferentes
polimerasas (Tabla MM4) y un termociclador (ver apartado MM9). 1.3.1. Reacción de RCP estándar
La reacción estándar se realizó siguiendo las recomendaciones del
fabricante de la polimerasa Pwo (Roche, Tabla MM4) para un volumen final de
50 l. En el caso de que la amplificación no se produjera de forma eficiente, se
incrementó la cantidad de Mg+2 o se utilizó la polimerasa PrimeStar (Takara,
Tabla MM4).
1.3.2. Reacción de RCP inversa
La confirmación del punto de inserción de la construcción UAS‐Flag‐Cbt en
la línea 6.1, se realizó mediante RCP inversa siguiendo el método propuesto por
el BDGP (del inglés BerKeley Drosophila Genome Project)
(http://www.fruitfly.org/about/methods/inverse.pcr.html). Se amplificó la región
3´ del inserto, utilizando como cebador directo el Pyr4 y como reverso el Pyr1
(Tabla MM11) y una temperatura de hibridación de 55oC. Los productos de RCP
se purificaron por electroelución y se secuenciaron con los cebadores Sp3 y
Spep1 (Tabla MM11).
1.3.3. Retrotranscripción RT‐RCP
Esta técnica se realiza en dos pasos separados: primero se produce la
reacción de retrotranscripción (RT) y a continuación la reacción de amplificación.
Antes de la RT, el ADNg presente en las extracciones se eliminó mediante
digestión de 2 µg de ARN con ADNasa I de la siguiente forma:
4 µl de ARN 0,5 µg/µl
1 µl de tampón 10 X 15 min a TA e Inactivación ADNasa añadiendo 1 µl de EDTA 25 mM
1 µl de ADNasa I 10 min a 65oC
4 µl de H2O mQ (miliQ)
Seguidamente se realizó la RT para la síntesis de ADNc, utilizando como
molde 5 µl de la digestión con ADNasa I (≈ 1 µg de ARN) al Mix:
1 µl de dNTPs 10 mM 4 µl tampón 5 x
1 µl de Hexámeros 5 min a 65oC a cada tubo 7 µl de Mix 2 µl de DTT 0,1 M
5 µL de ARN e inmediatamente en 1 µl Inhidor ARNasa
5 µL H1O mQ hielo. +
1 µl (2 U) de polimerasa Transcriptasa Reversa SuperScript II (Amersham Bio)
Para que se llevara a cabo la reacción de RT, la mezcla se calentó a 25oC durante 3 min en un termociclador, seguido de 1 h a 42oC y 4 min a 70oC.
Como controles se realizaron las mismas reacciones bien sin enzima en la
mezcla de reacción o sin ARN molde. El ADNc se almacenó a ‐20oC. Para
comprobar que se había producido la reacción y poder cuantificar de forma
aproximada las concentraciones del producto obtenido, se midieron los niveles
1.3.4. RCP cuantitativa a tiempo real (qRCP)
Se realizaron en la empresa Imegen siguiendo las directrices MIQE (del
inglés Minimal Information about a Quantitative‐Real Time Experiment, Bustin et
al., 2009), utilizando sondas Taqman específicas de cada gen, un termociclador
LightCycler 480 II de Roche con software LightCycler® 480 software release 1.5.0
SP3, versión 1.5.0.39 y siguiendo las instrucciones del fabricante del kit utilizado:
LightCycler 480 Probes Master.
Cada sonda TaqMan contiene un grupo fluorescente denominado reporter
que emite fluorescencia a una determinada longitud de onda y un grupo
quencher que enmascara la fluorescencia del reporter. Durante la etapa de
extensión de la RCP, la actividad 5´‐3´exonucleasa de la Taq polimerasa, libera el
grupo reporter de la sonda provocando la emisión de fluorescencia, ya que en
este momento no se encuentra bajo la influencia del grupo quencher (Fig. MM1).
La fluorescencia emitida durante la hidrólisis de las sondas es detectada y
cuantificada por el sistema óptico del termociclador a tiempo real. De este
modo, es posible determinar la cantidad de ADN amplificado presente en la
reacción. La cantidad de ADN inicial está directamente relacionada con la
cantidad de fragmentos amplificados en cada ciclo de RCP. Las sondas TaqMan
utilizadas en este trabajo contienen el fluoróforo FAM como reporter y BHQ1
como quencher. El método de cuantificación empleado para el análisis de cada
uno de los genes fue el de Fit Points, y se realizaron 50 ciclos de amplificación.
Figura MM1. Reacción qRCP utilizando sondas TaqMan. (A) Esquema del principio de la reacción de polimerización. (B) Ejemplo de la representación de las gráficas de amplificación y de un equipo de qPCR.
La composición y las concentraciones de los reactivos de la reacción se
encuentran en las tablas MM13 y MM14
Tabla MM13. Concentraciones de los reactivos de la qRCP
CONCENTRACIÓN REACTIVOS
REACTIVO VOLÚMEN CONCENTRACIÓN FINAL Vt=20 µl
50 µM Oligo‐F 0,2 µl 0,5 µM
50 µM Oligo‐R 0,2 µl 0,5 µM
20 µM Oligo‐P (sonda) 0,2 µl 0,2 µM
Agua 1,4 µl
Total 2 µl
Tabla MM14. Composición estándar de la reacción de qRCP
REACTIVO VOLÚMEN Vf=20 µl
Lightcycler 480 Probes Master2x conc. 10 µl
Mix Específico (oligos/sonda) 2 µl
Agua 3 µl
Volúmen total 15 µl
Volúmen cADN 5 µl