RECOMMENDATIONS

personal técnico siga este procedimiento para la correcta ejecución del ensayo de Determinación de ácidos hipúricos totales en la orina en el Departamento de Riesgos Químicos.

Fundamento del método. El método se basa en la extracción de los ácidos hipúricos totales de la orina con una mezcla de éter etílico-etanol.

Después de desecado el extracto, en presencia de silica gel, se trata con p-dimetil aminobenzaldehído, que con la ayuda del calor forma un compuesto coloreado, al que se le determina la concentración por la intensidad del color que se lee a 460 nm en el espectrofotómetro.

Aplicable a: muestras de orina.

Responsabilidades. Es responsabilidad del personal calificado (técnico, ingeniero o licenciado en Química) que labora en el laboratorio, el cumplimiento de este instructivo.

El Jefe de Departamento supervisará su cumplimiento, así como el responsable de la calidad.

Operaciones preliminares. Se realizará la toma de muestra según el PNO. RQ.01.002.

Condiciones de seguridad. Se trabajará con las condiciones de seguridad reque- ridas para las muestras biológicas (según MP.RQ.01) y según las de cada equipo que se utilice.

Equipos, utensilios y medios de medición: – Espectrofotómetro UV-visible (INS.RQ.01.038). – Baño de aceite (INS.RQ.01.0).

– Agitador mecánico (INS.RQ.01.010).

– Centrífuga de hasta 2 500 r.p.m. (INS.RQ.01.036). – Tubos para ensayo con tapa.

– Pipetas graduadas. – Tubos de ensayo. – Tubos para centrifugar. Materiales y reactivos:

– Mezcla de éter etílico-etanol (PNO.RQ.01.003) (4.11.1). – Cloruro de sodio.

– Solución de referencia de ácido hipúrico 2 mg/mL (PNO.RQ.01.003) (4.11.2). – Silica gel 60 g para cromatografía de capa fina.

– Reactivo de color (PNO.RQ.01.003) (4.11.3). – Solución de timol al 10 % (PNO.RQ.01.003) (4.11.4). – Ácido clorhídrico.

Procedimiento:

Muestras. El trabajador estará expuesto como mínimo durante tres días para tomar la muestra. Se toma la orina durante las 4 últimas horas de la jornada laboral, se le añade como preservante 0,5 mL de solución de timol y se guarda en refrigeración para su ejecución que no excederá 48 h después de la toma de la muestra. En congelación puede conservarse durante un mes.

Técnica operatoria:

– Preparación de la porción de ensayo. A un volumen de orina que se vierte en un tubo de ensayo se le ajusta el pH a 2 con ácido clorhídrico.

– Determinación. Se toma 1 mL de orina y se pasa a un tubo de 10 mL con tapa, se satura con 0,3 g de cloruro de sodio. El ácido hipúrico se extrae dos veces con 2 mL de la mezcla de éter etílico-etanol. Después de cada extracción se se- para la capa superior a otro tubo de ensayo, y de los extractos unidos se toma 1 mL y se diluye con 9 mL de la mezcla éter etílico-etanol.

Se vierte 1 mL del extracto diluido en un tubo para ensayo con tapa de 10 mL que contiene 0,5 g de silica gel y el disolvente se elimina por evaporación con corriente de aire.

Cuando se ha evaporado todo el disolvente (que no presenta olor a éter), se añade 1 mL del reactivo de color, se mezcla bien y se calientan los tubos en baño de aceite a 135 °C exactos durante 3 min. Se deja enfriar y se centrifuga cada vez, se unen los extractos y se centrifuga durante 10 min a 2 500 r.p.m. El sobrenadante, completamente transparente de color amarillo, se pasa a un tubo de ensayo y se leen las muestras contra el blanco a 460 nm en el espec- trofotómetro.

– Ensayo en blanco. Se sigue todo el proceso, utilizando agua bidestilada en vez de la orina.

– Curva patrón y calibración. Para preparar la curva se utiliza agua bidestilada ajustada a pH 2, también se ajusta el pH de la solución de referencia y luego se unen en las cantidades que aparecen para cada punto. Se preparará según PNO.RQ.01.003 (4.11.5). Se continúa como se indica en el procedimiento de las muestras.

Se utiliza un punto de la curva cuando se realizan las muestras, el punto corres- ponde a un contenido de ácido hipúrico de 0,6 gramos.

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Medición fotométrica. Las mediciones se realizarán en el espectrofotometro UV-VIS se ajustan los parámetros y demás pasos de la operación indicados por el fabricante. La medición fotométrica se realiza a 460 nm.

La concentración en las muestras se obtendrá por interpolación en recta de regresión ajustada por el método de mínimo cuadrado (RL), en el cual se observa el comportamiento gráfico de la curva y la linealidad (r2_>0,99).

El equipo de absorción atómica utiliza este sistema estadístico para la cuantifica- ción de los resultados de manera automática por medio de una computadora acoplada al equipo. Se recogen los datos manualmente en la libreta de trabajo.

Expresión de los resultados. Cálculos para cuando solo se lea el valor de absorbancia. La concentración se calcula mediante la fórmula siguiente, si se utiliza el gráfico de calibración:

C = DOM • f = g de ácido hipúrico total/L Si se utiliza el punto de calibración:

donde:

DOM: Densidad óptica de la muestra.

DOP: Densidad óptica de la solución de referencia. cp: Contenido del punto de referencia en miligramo. f: Factor del gráfico de calibración.

Los resultados se aproximan hasta la décima.

Casi siempre las muestras se realizan por duplicados y se promedian para emitir el resultado final.

Los resultados de los análisis se informarán en las respectivas órdenes y, cuando sea una entidad, se realizará un informe según el modelo.

Registro. Es obligatoriedad del técnico anotar en el registro correspondiente a la toma de muestra el número de registro, la fecha, nombre y apellidos del paciente, análisis solicitados, procedencia y cualquier observación necesaria.

En el registro de uso del equipo deberán anotarse los datos de la determinación según PNO.

Es responsabilidad del técnico anotar en el registro de entraba, así como en la orden, el resultado del paciente, si se requiere un informe, el responsable de la calidad deberá confeccionarlo.

Vigencia/periodicidad. Este documento es de carácter permanente hasta tanto no se aprueben otras resoluciones y legislaciones por los organismos rectores de la actividad, y se utilizará cada vez que se efectúe la determinación de ácidos hipúricos totales en la orina.

Aprobaciones:

Nombre y apellidos

Cargo Firma Fecha de

implantación

Elaborado por: Lic. Arelis

Jaime Novas Aspirante a Investigadora Revisado por: Téc. María

Elena Guevara Técnica de Laboratorio Aprobado por: Ing. Heliodora

Díaz Jefa de Departamento

Separación de ácido hipúrico y metilhipúrico