Chapter 5: Conclusions and Recommendations
5.2 Recommendations
JARAMILLO ML*a; DIAZ OF a; AGUILAR RFa; CEBALLOS PHb; GONZALEZ
GXEb
a CENID-Microbiología INIFAP, b FMVZ-UNAM
El objetivo fue evaluar la secreción de interferón gamma (IFN-γ) en cultivos de células mononucleares estimuladas con LPS (lipopolisacárido), polisacáridos capsulares y la adhesina de 70 kDa de M. haemolytica A1 en corderos infectados experimentalmente con la bacteria y animales sin infectar. Primeramente, se purificó el LPS y los polisacáridos capsulares por métodos químicos establecidos; mientras que la hemaglutinina se aisló a partir de extractos salinos proteicos de la bacteria por isoelectroenfoque. Un grupo de ocho corderos criollos de dos meses de edad se infectaron experimentalmente por vía intratraqueal aplicando 3 ml de una suspensión de la bacteria 1x 109 UFC/ ml; como control se utilizaron cuatro corderos sin infectar. Se obtuvo sangre cada tercer día de ambos grupos de animales con el propósito de separar por gradientes de ficoll las células mononucleares (CMN); las cuales se ajustaron a una concentración de 5x 106/1.5 ml en medio RPMI suplementado y distribuyeron en placas de 24 pozos, los cultivos se estimularon con 0.5 µg de la adhesina y 1µg de los otros antígenos, como control positivo de estimulación se empleo concanavalina A y se dejaron pozos sin estimular. Los cultivos se incubaron por 6, 24 y 72 h a 37 C en estufa de CO2. Posteriormente se colectaron los
sobrenadantes de cultivo para evaluar la producción de IFN-γ mediante un ensayo de ELISA. Los resultados se expresaron como índices de estimulación (IE), DO (densidades ópticas) de los cultivos estimulados/ DO de los cultivos sin estimular. Los valores de IE para ambos grupos con LPS fueron de 1.3 y 1.2 respectivamente; mientras que, los IE con polisacáridos fue de 1.2 y 1.0; para los estimulados con la adhesina fueron de 1.2 para ambos grupos en los diferentes tiempos de incubación. Mientras que los índices estimados en los cultivos estimulados con concanavalina fueron de 6.7 y 5.8. De acuerdo con los resultados los componentes no inducen la liberación de cantidades importantes de IFN-γ en CMN de animales infectados; el LPS de la bacteria es considerado como uno de los principales componentes activadores de citocinas proinflamatorias, por tanto resulta contradictorio este hecho, es probable que existan diferencias a nivel de expresión de genes; una evaluación a ese nivel ayudará a entender las diferencias, junto con la evaluación de otras citocinas con mayor potencial proinflamatorio.
CONDICIONES DE MOVILIDAD IN VITRO, Y CLONACIÓN DEL GEN fliC DE Pasteurella multocida.
Andrade TA1*, García PRM2, García GO1, Vaca PS1, Monsalvo A1, y Negrete AE1 FES-Iztacala1 y CINVESTAV-IPN2
Los miembros del género Pasteurella han sido considerados como microorganismos inmóviles incapaces de producir estructuras locomotoras llamadas flagelos. El objetivo del presente trabajo fue determinar las condiciones bioquímicas bajo las cuales Pasteurella multocida (Pm) sea capaz de presentar movilidad. Para ello, se realizaron diferentes ensayos de movilidad en agar semisólido a diferentes concentraciones de agar y glucosa, incubando a diferentes temperaturas y agregando diferentes sales a los medios de cultivo. Se observó una movilidad óptima con 0.2% de agar, incubando a 37-40°C y un requerimiento de NaCl, K2HPO4 y glucosa a concentraciones de 17, 2.5 y
27 mM respectivamente. El segundo objetivo fue determinar, mediante la técnica de PCR, la presencia de un probable gen fliC en el cromosoma de Pm, gen que codifica para la flagelina, subunidad única del filamento flagelar, para lo cual se emplearon los oligonucleótidos previamente descritos para la amplificación del gen fliC de Actinobacillus pleuropneumoniae. El producto de esta amplificación fue de ~ 990 pb, y se clonó en el vector pCR2.1 para su posterior secuenciación. Esta secuencia se analizó en BLASTn para compararla con genes fliC reportados, encontrando alta homología con el gen fliC de Pseudomonas aeruginosa y de otras bacterias gram-negativas. Estos resultados nos permiten concluir que Pm es una bacteria móvil que posee una secuencia altamente homóloga al gen fliC de otras bacterias.
INHIBICIÓN DE LA ADHESIÓN DE Actinobacillus pleuropneumoniae SEROTIPO 1 A COLÁGENA DE PULMÓN DE CERDO.
Enríquez VI1*; Godínez VD1; Martínez ZR1,3; Tenorio GVR2; Guerrero BAL4; de la Garza AM1.
1CINVESTAV-IPN. Depto. de Biología Celular.2CENID-Microbiología, INIFAP. 3UPIBI-IPN. Depto. de Biología. 4UAA. Depto. de Morfología.
La matriz extracelular (MEC) es un complejo estructural localizado por debajo de las células epiteliales y endoteliales y rodeando el tejido conjuntivo, compuesto por carbohidratos y proteínas. La proteína más abundante es la colágena que se encuentra distribuida en todo el organismo; en el pulmón de cerdo se encuentra formando parte del parénquima pulmonar y representa el 60% de la proteína total. El pulmón es el órgano blanco de Actinobacillus pleuropneumoniae (App), bacteria que causa la pleuroneumonía porcina, enfermedad del tracto respiratorio del cerdo que produce grandes pérdidas económicas a nivel mundial. App serotipo 1 se adhiere fuertemente a colágena tipo III de pulmón de cerdo por medio de una proteína de membrana externa (PME) de 60 kDa. El objetivo de este trabajo fue evaluar la inhibición de la adhesión de App a colágena y observar la participación de la PME de 60 kDa en esta adhesión. Se purificó la proteína de 60 kDa de App por medio de columna de afinidad y electroelución, una vez purificada se realizó isoelectroenfoque para ver las posibles isoformas y se elaboraron anticuerpos policlonales contra la PME en conejo. Estos se utilizaron para observar el reconocimiento de la proteína de 60 kDa en la bacteria por medio de inmunolocalización por microscopía electrónica y además la participación de esta proteína en la adhesión bacteria-colágena por ELISA. Se obtuvo la PME de 60 kDa pura, sin presentarse contaminaciones por otras proteínas, solamente se observó una forma de la proteína a un punto isoeléctrico de 7. Los anticuerpos dirigidos contra esta proteína tuvieron un titulo elevado y se inmunoadsorbieron en Escherichia coli HB101, para evitar reacciones cruzadas. Con los anticuerpos se detectó la proteína de 60 kDa en la estructura bacteriana con oro coloidal. La mayor inhibición de la adhesión bacteria-colágena es llevada a cabo cuando se incubó a la bacteria con anticuerpos contra la proteína de 60 kDa a una dilución de 1:10 (70%), incrementándose la adhesión a mayor dilución del anticuerpo utilizado. Estos resultados indican que la PME de 60 kDa de App participa en el reconocimiento bacteria-colágena y puede ser el mecanismo por el cual se este llevando a cabo la adhesión de la bacteria al pulmón de cerdo.
CLONACIÓN DEL GEN DE LA ADHESINA DE 60 KDA DE Actinobacillus
pleuropneumoniae.
Enríquez VI1*; Godínez VD1; Martínez ZR1,3; Tenorio GVR2; Guerrero BAL4; de la Garza AM1.
1CINVESTAV-IPN. Depto. de Biología Celular. 2CENID-Microbiología, INIFAP. 3UPIBI-IPN. Depto. de Biología. 4UAA. Depto. de Morfología.
Algunas proteínas de membrana externa (PME) se han descrito como adhesinas que reconocen moléculas específicas en el hospedero. Microorganismos patógenos se unen exclusivamente a colágena empleando diferentes estructuras como: fimbrias (Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae), proteínas de membrana (S. aureus, S. pyogenes), PME (Y. enterocolytica, Prevotella intermedia, A. actinomicetemcomytans). Actinobacillus pleuropneumoniae (App) se adhiere a colágena tipos I, III, IV y V por medio de una PME
de 60 kDa, la cual fue identificada como una adhesina ya que interactúa en la unión bacteria-colágena. El objetivo del trabajo fue clonar el gen que codifica para la PME de 60 kDa y ver su expresión en E. coli. Se construyó un banco genómico de App cortado con
SauA3I y ligado al pBluescript SK+ que fue cortado con BamHI, después fue transformado en células competentes de E. coli HB101 y sembradas en agar Luria-Bertani, ampicilina y X-Gal. La identificación de las clonas positivas, se realizó con un anticuerpo contra la PME de 60 kDa por inmuno-dot. Seleccionadas las clonas, se realizó el ensayo de adhesión a colágena de pulmón de cerdo por medio de Dot-blot, y se confirmó la expresión del gen reconociendo las colonias con el anticuerpo contra la proteína de 60 kDa por Colony-dot. Se obtuvieron proteínas totales, se analizaron por SDS-PAGE al 10% y por Wenstern-blot se verificó la expresión de la proteína. Se extrajo el DNA total de App, E. coli, P. multocida y M. hemolytica por el método fenol-CCl3 y DNA plasmídico de C3 por lisis alcalina. Se
realizó la hibridación de los DNAs totales con DNA plasmídico por la técnica de digoxigenina. Se identificaron dos clonas que expresan el gen que codifica para la proteína de 60 kDa (clonas positivas C3 y C4), estas clonas se adhieren a colágena tipos I, III, IV y V de pulmón de cerdo. Las clonas C3 y C4 expresan dos proteínas una de 60 kDa y otra de 72 kDa, pero App sólo presenta la de 60 kDa y E. coli no es reconocida por el anticuerpo. El DNA de C3 hibrida con DNA de App, pero no con DNA de E. coli, P. multocida y M.
haemolytica. Por lo tanto estos resultados indican que el gen que codifica la proteína de 60
PROTEÍNAS COMPARTIDAS POR Actinobacillus pleuropneumoniae 1, 3, 5 Y 7 CON MICROVESÍCULAS
González JSF*1,2; Martínez ZR1,2; Godínez VD1; Enríquez VI3; Tenorio GVR3; De la Garza AM1.
1CINVESTAV-IPN Depto. Biología Celular. 2UPIBI-IPN. 3INIFAP-CENID
Microbiología.
Actinobacillus pleuropneumoniae (App) es el agente etiológico de la Pleuropneumonía
porcina (PP). Se han identificado 13 serotipos, en base al antígeno capsular de los cuales los más frecuentes en México son 1, 3, 5 y 7. App posee factores de virulencia: cápsula, lipopolisacárido, proteasas, exotoxinas, fimbrias y proteínas de membrana externa (PME). Estas proteínas se identificaron por su perfil electroforético y se observó que los serotipos 1 y 9; y 2 y 6 son idéntico, mientras que los serotipos 3, 4, 5, 7 y 8, son diferentes entre sí y se presenta una PME de 40 kDa en todos los serotipos. Dada la distinta distribución de proteínas en los diferentes serotipos, el objetivo de este trabajo fue comparar las proteínas presentes en los serotipos de mayor incidencia en México con microvesículas (MV’S) de App serotipo 1. Se obtuvieron MV’s y proteínas totales de los serotipos 1, 3, 5 y 7. Se observaron ambas estructuras por microscopía electrónica para ver su integridad. Se comparó el perfil electroforético por SDS-PAGE al 10% y se tiñeron con Azul de Coomasie y Plata. Por Western Blot (WB) se detectaron las proteínas inmunogénicas de las MV’s y de los serotipos de App con -suero contra MV’s y bacteria completa serotipo 1. La presencia de MV’s y bacteria fue demostrada por microscopía electrónica. El patrón electroforético de MV’s y de bacteria indica que se comparten 10 bandas. Por WB se detectaron con el suero -MV’s fueron 5 bandas en MV’s y 4 en App 1; y con el -App1, se reconocieron las mismas bandas en las MV’s y en App1. El patrón electroforético de los serotipos 3, 5 y 7 es idéntico y con el -MV’s se reconocieron 3 bandas en los serotipos 3 y 5; y 2 del 7. Con el -App1 se reconocen 2 bandas del serotipo 3 y 5, y solamente 1 del 7. Por lo tanto, algunas proteínas están presentes en varios serotipos de App y en MV’s. Agradecimiento a Esteban Molina y Magda Reyes por su ayuda técnica. Trabajo parcialmente financiado por CONACyT proyecto No. G38590-B.