Reinforcement Learning Agents

Los antifolatos fueron los primeros antimetabolitos en incorporarse a la clínica a finales de la década de 1940. Estos compuestos actúan como inhibidores competitivos de la enzima dihidrofolato reductasa que, como se ha descrito en el apartado 1.3.2. de esta memoria, es la enzima clave en el metabolismo del acido fólico. Su descubrimiento se produjo a raíz de la observación de que la administración de suplementos de ácido fólico a los pacientes con leucemia linfoblástica aguda empeoraba su evolución, mientras que una dieta pobre en ácido fólico producía una notable mejoría. Los primeros antifolatos en demostrar su actividad antineoplásica fueron la aminopterina (AMT) y el metotrexato (MTX). Éstos fueron sintetizados en el laboratorio del Dr. Yellapragada Subbarow y utilizados, por primera vez, por el Dr. Sidney Farber para el tratamiento de niños con leucemia linfoblástica aguda avanzada. El compuesto más potente resultó ser la AMT, que logró producir, por primera vez en la historia, la remisión de la enfermedad en 10 de los 16 niños en los que se probó. Estos resultados fueron publicados en 1948 en la prestigiosa revista New England Journal of Medicine, constituyendo una de las primeras quimioterapias anticancerígenas de la historia de la medicina (Farber et al., 1948). En la década de los 50, el MTX comenzó a reemplazar a la aminopterina debido a su menor toxicidad y, en las décadas sucesivas, su efectividad demostrada frente a diversos tipos de cáncer popularizó el uso de MTX e hizo que este se incorporara a los distintos regímenes anticancerígenos (Bertino, 2000).

En los años siguientes al descubrimiento de la efectividad de estos fármacos comenzó una búsqueda activa de la enzima diana de los mismos. A medida que se fue elucidando el metabolismo del ácido fólico, se fue testando el efecto de la AMT y el MTX sobre la actividad de las diversas enzimas implicadas en las transferencias de un carbono, pero ninguna de ellas resultó ser la diana de estos compuestos. En 1958, Osborn y Huennekens descubrieron que la enzima responsable de la reducción del ácido fólico a TFH era la DHFR (Osborn y Huennekens, 1958) y, en el mismo año, estos mismos autores comprobaron que esta enzima era la diana farmacológica de la AMT y el MTX (Osborn et al., 1958). No fue hasta dos décadas más tarde, cuando se logró cristalizar los complejos enzima-inhibidor y elucidar completamente el mecanismo de acción de estos antifolatos (Schweitzer et al., 1990; Sawaya y Kraut, 1997).

Los inhibidores de la DHFR se clasifican en antifolatos clásicos y no clásicos. Los primeros se caracterizan por poseer una cadena lateral del PABA. Esta característica les hace sustratos de los mismos sistemas responsables del transporte de los folatos fisiológicos. Los antifolatos no clásicos sustituyen la cadena lateral del PABA por una cadena lateral hidrofóbica, lo que hace que entren en la célula por difusión simple y no sean sustratos de los sistemas de transporte de folatos. Como antifolatos clásicos destacan la AMT y el MTX; y como antifolatos no clásicos destacan el trimetoprim (TMP) y la pirimetamina (PYR) (Figura 1.31).

La toxicidad selectiva de los antifolatos sobre células que se están dividiendo activamente viene determinada por el consumo de THF para la síntesis de timidilato por la TS. En todas las reacciones de transferencia de un carbono que suceden en la célula se regenera el THF excepto en la reacción catalizada por la TS en la cual, además de producirse la transferencia de un carbono procedente del N5,N10-metilen-THF, se produce la oxidación del THF a DHF. Por ello, la actividad DHFR es esencial para la regeneración del THF que permite el funcionamiento de la TS y la síntesis de ADN. En células que están en fase S del ciclo celular, la inhibición de la DHFR conduce a un rápido descenso en los niveles de THF debido al elevado consumo por la TS, lo cual conduce a la inhibición de esta enzima, seguida de la inhibición de la síntesis de nucleótidos de purina y del ciclo de la metionina, lo cual provoca la muerte de la célula. Sin embargo, en células que no se están dividiendo y, por tanto, no están sintetizando activamente timidilato y ADN, la inhibición de la DHFR no produce un descenso tan elevado de los niveles de THF, por lo que no se bloquean estas vías (Schweitzer et al., 1990).

Aunque la mayoría de los antifolatos tienen como diana farmacológica a la DHFR, también se han sintetizado otros antifolatos que inhiben otras enzimas del ciclo del ácido fólico, como la TS o la AICARTF. Entre los inhibidores de la TS el más utilizado es el 5-fluorouracilo (5-FU).

1.3.4.1. Aplicaciones clínicas de los antifolatos

Además de utilizarse para el tratamiento de diversos tipos de cáncer, en la actualidad los antifolatos también se utilizan para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes.

Figura 1.31. Estructura de los antifolatos clásicos aminopterina (AMT) y metotrexato (MTX) y no clásicos trimetoprim (TMP) y pirimetamina (PYR).

Actualmente, se recomienda la administración de bajas dosis de MTX para el tratamiento de la enfermedad de Crohn, la psoriasis, la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple y ciertas clases de lupus. Estos efectos se deben a que el MTX, a través del bloqueo del ciclo del ácido fólico, posee propiedades antiinflamatorias, controlando la expresión de ciertos genes, dependientes del factor de expresión NF-B, y que incluyen por ejemplo a la ciclooxigenasa-2, el TNFα y ciertas citoquinas (Cutolo et al., 2001; Majumdar y Aggarwal, 2001).

Otros antifolatos tienen efectos antibacterianos y antiparasitarios gracias a que inhiben selectivamente a la enzima DHFR de bacterias y protozoos. Así, el TMP combinado con sulfonamidas constituye una terapia habitual para un gran número de infecciones bacterianas (de Roux y Lode, 2003), mientras que la PYR presenta una especificidad similar frente a la enzima de origen protozoario y se ha utilizado, por ejemplo, para el tratamiento de la malaria (Bell et al., 2008).

En cuanto a su uso en quimioterapia anticancerígena, en la actualidad el MTX es el antifolato más ampliamente usado para esta aplicación y se emplea para el tratamiento de cáncer de cabeza y cuello, mama, pulmón y próstata, entre otros (McGuire, 2003). Sin embargo, existen cánceres como el melanoma son especialmente resistentes a este agente (Kufe et al., 1980). Dado que esta Tesis Doctoral, se ha centrado en el estudio de la resistencia del melanoma a los antifolatos utilizando como modelo el MTX, a continuación se describen en detalle las características de este fármaco.

1.3.4.2. Metotrexato

El MTX difiere del ácido fólico en la sustitución del grupo oxo en la posición 4 del anillo de pteridina por un grupo amino, al igual que la AMT, y en la introducción de un grupo metilo adicional en la posición 10 (Figura 1.32). Estas mínimas alteraciones estructurales hacen que la DHFR presente mayor afinidad por el MTX que por sus sustratos e impiden que pueda ser reducido por ella, convirtiéndolo en un inhibidor competitivo respecto al folato o al DHF.

Este incremento en la afinidad se atribuye a un aumento de las interacciones del inhibidor con la enzima. La sustitución del grupo 4-oxo del folato por un grupo amino en el MTX aumenta la basicidad

Ácido fólico

Metotrexato

Figura 1.32. Estructura del ácido fólico y del metotrexato señalando las diferencias entre ambas moléculas (flechas rojas).

del N1, el cual se encuentra protonado en el MTX, a diferencia del folato en el que se encuentra protonado el N3 (Cocco et al., 1983). Este cambio de basicidad lleva a que la interacción iónica con el residuo ácido conservado en el centro activo (Asp-27 en las enzimas bacterianas y Glu-30 en las animales) sea más favorable con el N1 que con el N3 en el complejo de la enzima con el inhibidor, para lo que la molécula de MTX tiene que girar 180º respecto al enlace C6-C9 (Figura 1.33) fortaleciendo así dicha interacción, ya que establece dos puentes de hidrógeno adicionales. Este giro de 180º se da, en general, en los antifolatos 2,4-diamino respecto a los sustratos e inhibidores 2- amino-4-oxo como el DHF y el folato (Cody et al., 2004).

El MTX es un excelente inhibidor de la DHFR (Ki = 5 pM). Sin embargo, a pesar de esta gran potencia inhibitoria, muchos estudios indican que la concentración intracelular de MTX necesaria para inhibir la síntesis de THF in vivo debe ser al menos de 1 µM (Appleman et al., 1988; Domin et al., 1982; Rosowsky et al., 2000). La base molecular de esta discrepancia entre la inhibición de DHFR en sistemas in vivo e in vitro es conocida actualmente (Jackson y Harrap, 1973; Jackson et al., 1977; White, 1979; White y Goldman, 1981). La actividad de la DHFR en las células es muy alta comparada con la actividad relativa de la TS, por lo que los niveles intracelulares de DHF son muy bajos (≈ 10 nM) (Moran et al., 1976). Debido a que la Km de la DHFR por el DHF está en el rango de 1 µM, la enzima trabaja en cinética de primer orden sobre su sustrato, es decir, muy lejos de las concentraciones de saturación. En estas condiciones, sólo una pequeña fracción de la actividad DHFR es necesaria para satisfacer las necesidades celulares en cuanto a la síntesis de THF. Sin embargo, una vez que las células han sido expuestas al MTX, y este se une fuertemente a la enzima, la concentración de DHF aumenta y se acumula en la célula, uniéndose a la fracción libre de la DHFR. Inicialmente, la unión de DHF a la DHFR mantiene una velocidad constante en la formación de THF; sin embargo, una vez que la concentración de DHF aumenta unas 1000 veces (desde 10 nM hasta 10 µM), éste empieza a competir con el MTX por la unión a la DHFR. Por este motivo, la concentración de MTX en las células debe ser mucho mayor para inhibir la DHFR en el interior de la célula. Otro factor que afecta la citotoxicidad del MTX es su tasa de poliglutaminación como veremos en el apartado 1.3.6.

Met20 loop

F-G loop G-H loop

NADP+

MTX

En la actualidad, el MTX es el antifolato más ampliamente usado en oncología clínica para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda, linfomas no-Hodgkin’s, cáncer de mama, cáncer de cabeza y cuello, coriocarcinoma, sarcomas osteogénicos y otras leucemias. Además, también se ha empleado para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes como el asma, la artritis reumatoide, la colitis ulcerosa, el lupus eritematoso, el rechazo de transplantes y la psoriasis, por sus propiedades antiinflamatorias e inmunosupresoras (Cutolo et al., 2001; Prichard et al., 1993; Tian y Cronstein, 2007; van Ede et al., 1998).

Por otra parte, el leucovorín se usa como antídoto en terapias de rescate después de la administración de altas dosis de MTX. Éste compite con el MTX y sus metabolitos por el transporte, la poliglutaminación y la unión a la DHFR. Además, permite recuperar los niveles de folatos reducidos evitando la inhibición de la DHFR. Estos procesos ocurren más eficientemente en el tejido normal que en el tumoral y, así, se rescatan preferentemente las células normales (McGuire, 2003). A pesar de su utilidad, el MTX presenta ciertas desventajas. Entre ellas se encuentra el estrecho espectro de tumores a los que se aplica, especialmente en lo que a tumores sólidos se refiere, la incapacidad de traspasar la barrera hematoencefálica y la resistencia intrínseca y adquirida hacia el MTX de algunos tumores que limita su eficacia clínica. Otra desventaja del uso del MTX es su alta toxicidad general, que produce daños a nivel de la medula ósea, ulceración gastrointestinal y daño hepático y renal (Takimoto, 1996).