Research Hypothesis and Model Specification 96 

En nuestro estudio, hemos caracterizado los fenotipos de las distintas líneas transgénicas usando diferentes tratamientos de estrés. En todos los tratamientos de estrés se han empleado plántulas de 3-4 semanas tras la germinación, cultivadas en medio MS sólido sobre papel de filtro (50 g m-2), bajo condiciones normales de cultivo in vitro (ver Sección 1.1.3.).

11.1. Tratamientos de deshidratación severa DT2.

Los tratamientos de deshidratación DT2 se realizaron tal como fue descrito en Prieto- Dapena et al. (2008):

Los ensayos de deshidratación se realizaron en recipientes cilíndricos de vidrio formados por dos partes superiores de placas Petri de vidrio de 14 cm de diámetro que, al cerrar una sobre otra, forman un espacio interno de 3 cm de altura y 295 ml de volumen. En el interior del recipiente, en el centro del cilindro inferior, se fijó la tapa de una placa Petri de plástico de 9 cm de diámetro, formando el receptáculo donde posteriormente se colocaron las plántulas para su deshidratación. En el espacio en forma de anillo situado entre ambas placas Petri, se añadieron 9 g de sílica gel (en esferas de 3-6 mm de diámetro, con indicador de cloruro de cobalto;

Panreac). El sílica gel se trató previamente durante toda la noche a 80 oC, para maximizar la absorción de agua durante el tratamiento.

Las plántulas cultivadas sobre papel de filtro en medio MS sólido, se pasaron a un disco de papel de aluminio (de aproximadamente 8,3 cm de diámetro), previamente pesado. Para obtener los mismos niveles de deshidratación dentro de cada pareja de líneas NT/T, el disco de

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papel de aluminio se dividió en dos mitades iguales, colocando en cada mitad 20 plántulas de una línea, y en la otra mitad, 20 plántulas de la correspondiente línea hermana, previamente pesadas. Los discos de papel de aluminio con las plántulas se colocaron dentro del receptáculo central del recipiente cilíndrico y se añadió el sílica gel en el anillo exterior al receptáculo. El recipiente se cerró herméticamente y se incubó durante 8 h a 25 oC en la oscuridad.

Para el análisis de la supervivencia tras los tratamientos de deshidratación, se añadieron 6 ml de agua desionizada (MilliQ), se rehidrataron durante 1 h a 25 oC en oscuridad, y posteriormente se dejaron recuperar bajo condiciones normales de cultivo in vitro (ver Sección 1.1.3.). Tras 7 días de recuperación, se fotografiaron las plántulas y se cuantificó la supervivencia.

Para la medida de Fv/Fm tras la deshidratación en las plántulas 35S:A9 y NT, se modificaron

los tratamientos DT2, sustituyendo el disco de papel de aluminio por portaobjetos de vidrio (76 x 26 mm), y reduciendo la cantidad de sílica gel a 5 g. En cada portaobjetos, se colocaron 9 plántulas de una misma línea. En cada recipiente, se colocaron 2 portaobjetos, correspondientes a una línea 35S:A9 y su línea hermana no transgénica.

El contenido de agua tras la deshidratación se calculó en relación al peso seco, obtenido tras secar las plántulas durante 16 h a 160 oC. El potencial hídrico se calculó a partir del contenido de agua tras la deshidratación, siguiendo las isotermas de desorción de agua descritas por Prieto- Dapena et al. (2008).

11.2. Tratamientos de estrés oxidativo con H

O

.

Para los tratamientos de estrés oxidativo, el papel de filtro (50 g m-2) sobre el que se cultivaron las plántulas, con aproximadamente 60 plántulas por placa Petri, se pasó del medio MS sólido a una solución de lavado con la correspondiente concentración de H2O2 usada en el

tratamiento: 0 mM H2O2 para los tratamientos control, y 200 o 300 mM para los tratamientos

estándares (también se usaron tratamientos con 50 y 500 mM en experimentos preliminares, ver Figura r8). Las soluciones se suplementaron con un agente surfactante, añadiendo 0,1 % Tween-20 (Sigma-Alrich) (v/v), para facilitar la penetración de la solución dentro de la plántula. Tras el lavado, el papel de filtro con las plántulas se colocó en una placa Petri sobre 6 papeles de filtro (73 g m-2) humedecidos con 6 ml de la correspondiente solución con H2O2. Las placas Petri

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se incubaron durante 24 h a 20-25 oC en oscuridad. Tras el tratamiento, las plántulas se lavaron con agua desionizada (MilliQ).

Para el análisis de la supervivencia tras los tratamientos con H2O2, se sellaron las placas Petri

con las plántulas lavadas, y se dejaron recuperar bajo condiciones normales de cultivo in vitro (ver Sección 1.1.3.). Tras 7 días de recuperación, las plántulas se fotografiaron y se cuantificó la supervivencia.

11.3. Tratamientos de inducción de la senescencia vegetativa.

11.3.1. Inducción de la senescencia en la oscuridad.

Para los tratamientos de inducción de la senescencia en la oscuridad, el papel de filtro (50 g m-2) sobre el que se cultivaron las plántulas, con aproximadamente 60 plántulas por placa Petri, se lavó 2 veces con agua desionizada (MilliQ) estéril, para eliminar restos de medio MS. Tras el lavado, el papel de filtro con las plántulas se colocó en una placa Petri sobre 6 papeles de filtro (73 g m-2) humedecidos con 6 ml de agua desionizada (MilliQ) estéril. Las placas Petri se sellaron y se envolvieron con papel de aluminio doble, y se colocaron dentro de una caja opaca para evitar cualquier entrada de luz. La caja se incubó hasta un máximo de 5 semanas a 24-25 oC. Tras este periodo, el papel de filtro con las plántulas se pasó a placas Petri con medio MS sólido. La cuantificación de pigmentos fotosintéticos y la medida de Fv/Fm se hicieron inmediatamente

tras el tratamiento. Para el análisis de la supervivencia tras el tratamiento en la oscuridad, las plántulas se dejaron recuperar bajo condiciones normales de cultivo in vitro (ver Sección 1.1.3.). Tras 7 o 10 días de recuperación, las plántulas se fotografiaron y se cuantificó la supervivencia.

11.3.2. Inducción de la senescencia por falta de nutrientes a la luz.

Para los tratamientos de inducción de la senescencia por falta de nutrientes a la luz, el papel de filtro (50 g m-2) sobre el que se cultivaron las plántulas, con 21 plántulas por placa Petri (dispuestas en torno al centro de la placa), se lavó 2 veces con agua desionizada (MilliQ) estéril, para eliminar restos de medio MS. Tras el lavado, el papel de filtro con las plántulas, se colocó en una placa Petri sobre 6 papeles de filtro (73 g m-2) humedecidos con 6 ml de agua desionizada (MilliQ) estéril. Las placas Petri se sellaron y cultivaron durante 6 días en ciclo de luz 16 h/8 h

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(día/noche) a una intensidad de luz de aproximadamente 300 μmol m-2 s-1, y a 24-25 oC. Inmediatamente tras el tratamiento, se cuantificaron los pigmentos fotosintéticos, el valor de Fv/Fm y la supervivencia, y se fotografiaron las plántulas.

11.4. Tratamiento de aclimatación al calor.

Para la aclimatación al calor, las placas Petri con las plántulas cultivadas en medio MS

sólido, se sellaron herméticamente con papel de plástico, para evitar la entrada de agua. Las placas se sumergieron en un baño con agua a 40 oC durante 3 h.

Inmediatamente tras el tratamiento de aclimatación al calor, el material vegetal se congeló con N2 líquido y se conservó a -80 oC para el análisis de proteínas, o se sometieron al

correspondiente tratamiento con H2O2 o de termotolerancia.

11.5. Ensayos de termotolerancia.

Para los ensayos de termotolerancia, se usaron plántulas cultivadas bajo condiciones normales de cultivo in vitro, y plántulas previamente acondicionadas al calor (ver Sección 11.4.). Las placas Petri con las plántulas cultivadas en medio MS sólido se sellaron herméticamente con papel de plástico, para evitar la entrada de agua. Las placas se sumergieron en un baño con agua a 48 oC durante 2,5 h. Tras el tratamiento a 48 oC, se eliminó el papel de plástico y se dejaron recuperar las plántulas bajo condiciones normales de cultivo in vitro (ver Sección 1.1.3.). Tras una semana de recuperación, se fotografiaron las plántulas.