Research methods

El primer problema que se planteaba para obtener la secuencia completa de una variante agresiva de CTV capaz de inducir SP en pomelo y/o naranjo dulce era la elección de un aislado apropiado. El hecho de que los aislados de CTV sean poblaciones genéticamente no homogéneas que a veces contienen dos o más variantes de secuencia divergentes (Rubio et al., 2001, Ayllón et al., 2006), y que esta situación sea más frecuente en los aislados más agresivos (Sambade et al., 2002; Sambade et al., 2003; Targon et al., 2000; Vives et al., 2005), dificulta la obtención de una secuencia representativa al sintetizar cDNA de moldes correspondientes a distintas variantes de secuencia. Para evitar este problema, se examinó la estructura poblacional de los aislados inductores de SP de origen español, T305 y T318 (Moreno et al., 1993b) y de un grupo de siete sub-aislados obtenidos por transmisión por pulgón del aislado T318 a nuevos huéspedes (T318A). Mientras que los aislados T305 y T318 mostraron en distintas regiones genómicas un patrón de SSCP con cuatro o más bandas, que indicaba la presencia de al menos dos variantes de secuencia abundantes (Rubio et al., 2000), el patrón de SSCP de los subaislados T318A contenía únicamente dos bandas, que también estaban presentes en T318 y T305, lo que sugería que los sub-aislados T318A tenían una población más homogénea y que el proceso de transmisión por pulgón probablemente excluyó otras variantes (Albiach-Martí et al., 2000b). Estos resultados y la observación de que T318A inducía en naranjo dulce Pineapple síntomas de SP similares a los de T318 o T305, condujeron a la selección de este aislado para secuenciar su gRNA.

La estrategia de secuenciación elegida, dirigida a simplificar la preparación de un clon de cDNA de longitud completa, consistió en la síntesis de cuatro fragmentos solapantes de cDNA que cubrían todo el gRNA mediante RT-PCR larga evitando sesgar la población de partida. El hecho de que la identidad nucleotídica observada en las regiones solapantes de estos clones fuese del 100%, sugiere que la secuenciación se efectuó sobre la misma variante de secuencia. Por otro lado, la estrategia de

CAPÍTULO 1

73 secuenciación incluyó la selección de la variante de secuencia predominante en T318A mediante análisis de SSCP de múltiples clones de cada fragmento en comparación con los productos homólogos de RT-PCR obtenidos de dsRNA de este aislado. El hecho de que más del 97% de los clones compartiesen el mismo perfil de SSCP y que éste correspondiese al observado en el aislado original confirma la homogeneidad de la población de T318A y que los clones secuenciados corresponden a la variante de secuencia mayoritaria. Por otra parte, la disponibilidad de fragmentos de DNA con varios genes es una herramienta útil para comparar la variabilidad de distintos genes sobre una misma molécula, ya que los datos disponibles hasta el momento sobre variabilidad de distintos genes de CTV fueron obtenidos de productos separados de RT-PCR de la población de gRNAs, y por tanto no se conoce qué variantes de cada gen están realmente concatenadas.

El gRNA del aislado T318A presenta una organización genómica idéntica a la del resto de aislados de CTV secuenciados y los productos proteicos potencialmente codificados en sus 12 ORFs son también similares. Este aislado mostró los valores más elevados de identidad nucleotídica con los aislados más agresivos (98.4% con SY568R y 97.9% con NUagA) y los más bajos con T36 (77.3%), en particular en la mitad 5´ del gRNA, lo que apoya sugerencias previas sobre la posible naturaleza recombinante de este último aislado (Vives et al., 1999).

La elevada identidad de secuencia entre T318A, SY568R y NUagA se observó no sólo en las zonas codificantes sino en las UTRs. Las notables similitudes de secuencia entre el aislado español T318A y dos aislados agresivos de California (SY568R) y Japón (NUagA) son similares a las previamente establecidas entre los aislados T385 de España y T30 de Florida (Albiach-Martí et al., 2000a) o T36 de Florida y Qaha de Egipto. Esta elevada similitud entre aislados geográficamente separados y que aparentemente no han estado en contacto sugiere que puedan tener un ancestro común y que las altas presiones de selección en el genoma de CTV puedan limitar el repertorio de genotipos con capacidad para sobrevivir en la naturaleza. Hilf et al (1999) agruparon los aislados de CTV en dos genotipos

CAPÍTULO 1

74

basándose en la divergencia de secuencia de la mitad 5´ del genoma. Nuestro análisis filogenético de las ocho secuencias completas de CTV disponibles sugieren que el grupo VT definido por Hilf et al (2005) probablemente contiene al menos dos genotipos diferentes. Por otra parte, la comparación de secuencias nucleotídicas o aminoacídicas de estos aislados en distintas regiones del gRNA mostraron que para los genes p65, p61 y p27 los aislados inductores de SP en naranjo dulce y/o pomelo quedaban separados de los aislados no inductores de SP. Alineamientos múltiples de algunas regiones polimórficas mostraron posiciones nucleotídicas y/o aminoacídicas características de cada grupo que permitían diferenciar ambos tipos de aislados. Estas regiones serían buenas candidatas para delimitar determinantes de patogenicidad en un sistema genético basado en un clon de cDNA infeccioso del gRNA completo. Mientras esta posibilidad se concreta, también podrían servir como marcadores moleculares para diferenciar aislados inductores y no inductores de SP.

La homogeneidad genética de la población de T318A fue confirmada también mediante análisis de SSCP de múltiples clones de regiones de los genes p61 y p23 y de la 5’ UTR. En este análisis fue interesante constatar que dos plantas infectadas con T318A contenían únicamente secuencias de tipo II (Ayllón et al., 2001; López et al., 1998). Análisis anteriores habían mostrado que los aislados que contenían sólo secuencias de tipo III eran siempre poco agresivos, mientras que los aislados inductores de SP en naranjo dulce y/o pomelo siempre contenían secuencias tipo II, en combinación con secuencias tipo I y/o III (Ayllón et al., 2001). Esta es la primera vez que secuencias de tipo II se detectan solas en un aislado de CTV, lo que refuerza la asociación preliminar de este tipo de secuencia con los aislados agresivos inductores de SP (Ayllón et al., 2001). Esta asociación no significa una implicación directa de la 5´ UTR en la producción de síntomas, pero sugiere la co-evolución con otras regiones genómicas que pudieran ser responsables de la patogénesis. La no detección de secuencias 5´ UTR tipo III en plantas infectadas con T318A es consistente con la detección de una variante de secuencia muy mayoritaria en otras regiones genómicas.

CAPÍTULO 1

75 El aislado T318A fue obtenido a partir de un aislado no agresivo mediante transmisiones por distintos huéspedes en el invernadero, por lo que sólo se conocían sus efectos en algunas especies indicadoras obtenidas de semilla. Para conocer el daño potencial que T318A podría ocasionar en variedades comerciales, se inocularon por injerto combinaciones de naranjo dulce, mandarino, pomelo o zamboa sobre citrange Carrizo. La observación de SP en la mayoría de los naranjos dulces (Washington navel, Valencia y Salustiana) y que éste síntoma fuese intenso en el naranjo dulce Berna y el pomelo Star Ruby sugiere que el aislado T318A puede ser un riesgo potencial para la citricultura. Por otra parte, nuestros resultados indican que la zamboa Pink Pummelo es parcialmente resistente a este aislado ya que la detección del virus resultó imposible mediante técnicas serológicas y sólo se consiguió mediante RT-PCR convencional, lo que sugiere unas tasas de acumulación/replicación más bajas en este huésped. Este dato se confirma con técnicas más sensibles que permiten cuantificar la acumulación de CTV en el capítulo 2 de esta tesis.