Pretratamiento: Concentración
Para que una tinción sea positiva debe contener 105 bacterias por ml de muestra. Así, en los líquidos de territorios estériles, que suelen tener un número bajo de microorganismos, la microscopía es muy poco rentable. Por ello, algunos autores recomiendan en los líquidos pleurales llevar a cabo técnicas de concentración. Aunque la centrifugación parece la primera opción plausible, no es totalmente eficaz debido a que la densidad de flotación de las micobacterias está próxima a 1, lo que hace que muchas de ellas permanezcan en el sobrenadante. Sin embargo, sí parecen eficaces la superposición secuencial en un portaobjetos de varias gotas del fluido corporal no centrifugado o la filtración mediante una membrana de policarbonato.
Fundamento
Las micobacterias son difíciles de teñir debido a la gran dotación lipídica (ácidos micólidos) de su pared, que las hace impermeables a los colorantes habituales. Por ello, las tinciones utilizadas, como la de Ziehl-Neelsen, se basan en el hecho de su ácido-alcohol resistencia que, entre otras características, se manifiesta por la capacidad que tienen estas bacterias de retener un colorante básico, como determinados arilmetanos (fucsina), tras la acción de un decolorante ácido-alcohol. Para que estas bacterias puedan contrastar se utiliza un contracolorante (azul de metileno) que teñirá el resto de la preparación. No todas las estructuras ácido-alcohol resistentes son micobacterias. Existen otros microorganismos que pueden presentar grados diferentes de ácido- alcohol resistencia como son especies de Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordona, Legionella (L. micdadei), y los ooquistes de Cryptosporidium, Isospora, Sarcocystis y Cyclospora. Sin embargo, la especificidad del examen directo de la muestra para determinar el género es bastante elevada, pero la diferenciación a nivel de especie suele ser casi imposible.
Técnica de la extensión
Siempre se realizarán en una Cabina de Seguridad Biológica. Tras marcar en un extremo del portaobjeto el número de registro de la muestra a estudiar, se procederá de la siguiente forma:
o Muestras bronco-alveolares. Para las extensiones directas, seleccionar la parte más purulenta de la muestra. Con un asa bacteriológica estéril se cogerá una porción significativa de la misma y se extenderá sobre el portataobjetos (aproximadamente 1,5 cm de ancho x 3 cm de largo).
o Muestras traqueo-bronquiales (esputo y aspirado traqueal) Para las muestras pre- tratadas y concentradas por centrifugación, se homogeneizará el sedimento con la ayuda de una pipeta Pasteur de plástico y se transferirá una gota al portaobjetos que se extenderá como se ha mencionado previamente.
o Líquido pleural. Superposición secuencial en un portaobjetos de varias gotas. o No deberá preparar más de una extensión por portaobjetos.
o Fijar el material al portaobjetos mediante un calentador eléctrico (60 a 90ºC) o bien dejándolo secar al aire.
NOTA: La fijación mediante calor puede mantener la viabilidad de algunas micobacterias. Por ello, estas preparaciones deberían manejarse con extremo cuidado.
Técnica de tinción
o Colocar los portaobjetos sobre el soporte de tinción dejando suficiente espacio entre ellos para evitar arrastres y transferencias entre muestras diferentes.
o Cubrir la preparación totalmente con la solución de fucsina fenicada filtrada.
o Calentar suavemente el portaobjetos flameando varias veces (por ej., 3) la preparación hasta la emisión de vapores (aproximadamente 10 segundos), evitando la desecación y la ebullición. Esperar 5 minutos.
o Alternativamente el paso anterior se puede realizar calentando la preparación en un microondas a la intensidad mínima durante 1-2 min evitando la ebullición.
o Lavar con agua (preferiblemente destilada en muestras estériles) y decantar la preparación.
o Añadir el decolorante alcohol-clorhídrico (97ml alcohol y 3 ml de acido clorhídrico) y mantener hasta que no se desprenda más colorante, durante 2 min.
o Lavar con agua y decantar.
o Añadir el azul de metileno dejándolo durante 3 minutos. o Lavar con agua y dejar secar a temperatura ambiente.
Valoración
o Examinar en un microscopio (luz visible) con un objetivo de inmersión (x 100) con aceite.
o Se procurará seguir un orden dentro del portaobjetos (izquierda a derecha, zig-zag, etc.) iniciando la observación por un extremo del mismo.
Los bacilos ácido-alcohol resistentes se teñirán en rojo brillante sobre un fondo azulado. Estos tienen aproximadamente de 1 a 10 mm de longitud y de 0,2 a 0,6 mm de ancho, pueden estar ligeramente curvados y no suelen teñirse de manera uniforme adoptando un aspecto de granulado a lo largo del cuerpo bacteriano. Ilustración recomendada:
http://www.microbelibrary.org/images/delisle/images/mycobacterium%20tuberculos is%20fig1.jpg
o La morfología varía ligeramente de unas especies micobacterianas a otras, lo que ha llevado a intentar hacer un diagnóstico de especies a partir de las características microscópicas. Sin embargo esta tarea resulta muy arriesgada y poco recomendable aun en el caso de personal entrenado y con experiencia.
o En medio de cultivo líquido, Mycobacterium tuberculosis exhibe a menudo un aspecto de cuerdas serpenteantes, pero también ocurre con algunas micobacterias no tuberculosas (MNT).
o Las MNT pueden aparecer con aspecto pleomórfico, con formas cocoides, formando filamentos o teñidas uniformemente.
- M. kansasii suele ser de mayor tamaño que otras micobacterias y se tiñe irregularmente con un aspecto de bandas cruzadas o granulaciones a lo largo del cuerpo bacteriano, que le dan un aspecto arrosariado o “atigrado”. - Pueden existir formas cocáceas, muy frecuentes en aquellos individuos
sometidos a tratamiento antituberculoso.
4.1.5 Tinciones con fluorocromos
A) Tubo estéril con muestras respiratorias de vías bajas
Los fluorocromos auramina y rodamina tienen la propiedad de fijarse a las paredes celulares de las micobacterias, Se utiliza, además un colorante de contraste que tiene como función evitar la fluorescencia inespecífica.
Técnica
o Se cubre la preparación con la solución colorante (Auramina O, o Auramina- Rodamina), durante quince minutos.
o Se lava con agua destilada.
o Se cubre la preparación con solución decolorante (alcohol clorhídrico) dejándose actuar durante dos minutos.
o Se cubre la preparación con el colorante de contraste (Permanganato potásico o Naranja de acridina), y se deja actuar durante dos minutos.
o Se lava con agua destilada y se deja secar al aire.
Valoración
Se observa a microscopia de fluorescencia a x250 o x450, las bacterias ácido alcohol resistentes aparecen de color amarillo-naranja brillante sobre un fondo verdusco.
Ilustraciones recomendadas:
http://thales.cica.es/rd/Recursos/rd99/ed99-0043-01/tinci.htm
Las muestras deben procesarse en una cabina de bioseguridad, ya que los aerosoles producidos durante la siembra pueden ser causa de infecciones respiratorias adquiridas en el laboratorio. Procesar las muestras lo más rápidamente posible y seleccionar la parte de la muestra más purulenta o con sangre.
4.2 Cultivos bacteriológicos y fúngicos
4.2.1 Siembra