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Otra herramienta clave para el estudio de la genética, fisiología y metabolismo de las BAL consiste en la secuenciación completa de sus genomas. Esta área de conocimiento ha experimentado un rápido crecimiento en las dos últimas décadas. La primera bacteria láctica cuyo genoma se secuenció fue Lc. lactis subsp. lactis IL1403 en el año 1999 (Bolotin y col.,1999). Hoy en día, la base de datos más actualizada (GOLD genome online database; http://www.genomesonline.org) cuenta con 87 genomas completos de especies y cepas de BAL (9 Lactococcus, 39 Lactobacillus, 6 Leuconostoc, 5 S. thermophilus, 2 Oenococcus, 2 Pediococcus, 1 Weissella y 23 Bifidobacterium) y más de 300 genomas en proceso de secuenciación.

El genoma típico de una BAL es relativamente pequeño (entre 1,7 Mb en el caso de S. thermophilus y 3,9 Mb en el caso de Lactobacillus pentosus), con capacidad para codificar, por tanto, un número de genes limitado (desde unos 1.600 hasta unos pocos más de 3.000). Estos genomas tan reducidos contienen, sin embargo, una gran variedad de secuencias que codifican transportadores para la asimilación de las diversas fuentes de carbono y nitrógeno propias de los nichos que las BAL ocupan (Mayo y col., 2008). Al mismo tiempo, presentan una escasez de genes implicados en procesos biosintéticos y catabólicos. La amplia variación en el número de genes que presentan, incluso cepas de una misma especie, sugiere que el genoma de las BAL es plástico y dinámico (Mayo y col., 2008). Se cree que la diversificación genómica de las BAL a partir de sus ancestros se ha producido por la pérdida de genes mediante procesos de mutación y deleción y por la adquisición de otros genes

(mediante procesos de transferencia génica horizontal) que resultan ser clave para la adaptación a los nichos ecológicos que habitan (Price y col., 2011; Siezen y col., 2011).

La disponibilidad de los genomas de diversas cepas de BAL ha mejorado el conocimiento en detalle de muchas rutas metabólicas implicadas en las fermentaciones industriales y otras de gran importancia para la aplicación de las BAL como probióticos. En la industria alimentaria este conocimiento permitirá una mejor explotación de la capacidad fermentativa de las BAL (Liu y col., 2008; Branco dos Santos y col., 2013) y posibilitará la selección de los candidatos más adecuados para cada aplicación. El conocimiento detallado de los genomas facilitará también su manipulación genética, lo que resulta de mucho interés para la utilización de las BAL como factorías celulares. Por su carácter GRAS las BAL se contemplan como sistemas muy adecuados en aplicaciones biotecnológicas como la expresión de proteínas heterólogas, la síntesis de aditivos de grado alimentario y de compuestos beneficiosos para la salud (Hugenholtz y col., 2002; Hanniffy y col., 2004; Stanton y col., 2005). Además, se estudia activamente su empleo como vehículos para el suministro de vacunas orales (Wells y Mercenier, 2003; Wells, 2011).

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Tradicionalmente los procesos fermentativos se realizaban de forma empírica, siendo los microorganismos presentes en las materias primas o en el entorno de las elaboraciones (herramientas, aditivos, etc.) los responsables de la fermentación. Sin embargo, solo un pequeño número de cepas de estas especies poseen las propiedades requeridas por la industria, incluyendo rápido crecimiento en leche y en los medios de propagación industriales, producción de aromas deseables y resistencia al ataque de los bacteriófagos. Por estos motivos, existe una demanda continua de nuevas cepas con mejores características que puedan complementar o sustituir a las cepas comerciales que están actualmente en uso. También son necesarias nuevas cepas o cepas con nuevas propiedades para emprender fermentaciones novedosas.

Para cubrir estas demandas, los productos tradicionales elaborados con leche cruda sin la adición de fermentos conforman un enorme reservorio de nuevas cepas. Nuestra hipótesis de trabajo plantea que los productos lácteos fermentados contienen especies de BAL y otros tipos microbianos de interés para la industria. Los microorganismos que controlan las fermentaciones tradicionales dependen de la materia prima y de la selección que imponga los procesos tecnológicos de cada producto. Por tanto, para la identificación de especies y/o cepas nuevas es necesario caracterizar productos lácteos tradicionales y en particular los que presentan tecnologías originales de elaboración. Por otra parte, la utilización de técnicas microbiológicas novedosas, como las independientes de cultivo, pueden detectar

tipos distintos a los identificados hasta este momento que pueden requerir un aislamiento selectivo específico. En todo caso, las cepas seleccionadas deben de caracterizarse en profundidad y ensayarse, finalmente, en las condiciones de elaboración para asegurar la idoneidad de los tipos en la mejora del sabor, aroma, propiedades nutritivas y/o de conservación de los productos.

El objetivo final del trabajo se ha perseguido mediante la consecución de los siguientes objetivos parciales:

1.- Caracterización de productos lácteos tradicionales

1.1.- Evaluación y comparación de las técnicas de cultivo y las técnicas cultivo independientes para la caracterización microbiológica de productos lácteos.

1.2.- Estudio de la composición y evolución de la microbiota implicada en la elaboración y maduración del queso Casín tradicional, elaborado en nuestra región con leche cruda sin adición de fermentos.

1.3.- Caracterización de la microbiota implicada en la elaboración y maduración del queso tradicional polaco Oscypek, elaborado en la región de los montes Tatra en Polonia con mezcla de leche cruda de oveja y vaca y sin adición de fermentos.

1.4.- Estudio de la microbiota de una leche fermentada natural de origen desconocido, cuya producción se ha extendido por el noroeste de la Península y que se elabora mediante la adición a la leche de una alícuota de la leche fermentada precedente.

2.- Caracterización de microorganismos de interés tecnológico

2.1.- Análisis fenotípico y genotípico de cepas de la especie Lactococcus lactis aisladas de quesos tradicionales.

2.2.- Estudio de la actividad antimicrobiana de cepas salvajes de Lc. lactis contra microorganismos patógenos y alterantes.

2.3.- Identificación, tipificación y caracterización de cepas de Leuconostoc spp. para su empleo como cultivos adjuntos.

3.- Diseño y ensayo de fermentos diseñados con cepas de BAL de los productos lácteos tradicionales.

3.1.- Diseño de mezclas y evaluación de sus propiedades tecnológicas más importantes.

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Traditionally the processes of milk fermentation were carried out empirically, through the development and action of indigenous microorganisms present in the microbiota associated to the raw materials or others coming from the environment of processing, which includes tools and additives. Nowadays, dairy fermentations are taken over by starters, carefully selected microorganisms added in high numbers to milk in order to control manufacturing and/or ripening stages, or adjunct cultures, microorganisms with a major texture and/or aroma contribution to the final product. However, only a small number of strains possess the required properties that large-scale industrial processes demand, including insensitivity or resistance against the attack of bacteriophages. Therefore, there exists a recognized continuing demand for new strains or strains with improved functionality to complement or replace currently-in-use commercial strains.

In this sense, traditional dairy products made from raw milk without commercial starters have been found to constitute a large phenotypic and genetic reservoir, from which new starter strains could be selected. Beyond replacing starter components, traditional products may further contain strains with novel properties to enhance the overall quality of industrial and traditional milk fermentations and/or to undertake new dairy fermentations. Identification and selection of appropriate starter and adjunct cultures requires the microbial typing of traditional dairy products, the isolation, identification and characterization of large numbers of LAB

strains, and they assay of selected strains in pilot scale manufacture to assure they meet all required properties to be used in dairy. The use of such strains aims the manufacture of dairy products with improved aroma and taste, while increasing their safety and preservation abilities.

The final objective of this work was pursued by the following partial subobjetives.

1.- Characterization of traditional products

1.1.- Evaluation and comparison of culture-dependent and culture- independent methods for the microbial characterization of dairy products.

1.2.- Study of the composition and evolution of the microbiota involved in manufacturing and ripening of the traditional Casín PDO cheese, which is produced in Asturian Principality, Northern Spain, from raw milk without added starters.

1.3.- Microbial description the microbiota involved in manufacturing and ripening of the traditional Oscypek PDO cheese, produced in the Tatra Mountains region of Poland.

1.4.- Microbial typing of a homemade, natural fermented milk from undetermined origin but well spread in the North-West of Spain.

2.- Characterization of microbial populations with technological interest

2.1.- Detailed phenotypic and genetic analysis of Lactococcus lactis strains from traditional cheeses.

2.2.- Study of the antimicrobial activity of wild Lc. lactis strains against pathogens and spoiling microorganisms.

2.3.- Characterization of Leuconostoc spp. strains and evaluation of their suitability as adjunct cultures for dairy.

3.- Design and assay of starter mixtures based on wild LAB strains

3.1.- In vitro analysis of starter mixtures for technologically-important properties.

3.2.- Evaluation of the mixtures as cheese starters in pilot-scale, experimental trials.