Variable Argument Lists

Las propiedades sensoriales de los productos lácteos tradicionales dependen de una larga serie de factores entre los que podemos destacar la alimentación de los animales, las prácticas y tecnologías de elaboración y la composición cualitativa y cuantitativa de los microorganismos responsables de la acidificación y maduración (Cogan, 1997; Corroler y col., 1998). La composición y actividad de los tipos microbianos presentes en los productos lácteos juegan un papel crucial en el desarrollo de sus cualidades higiénicas y de conservación (Guinane y col., 2005). De esta forma, resulta esencial la identificación y caracterización de los

microorganismos que participan en la elaboración de los productos tradicionales para poder llegar a reproducir las fermentaciones de manera controlada. La estandarización es una importante forma de incrementar la calidad y salubridad de estos productos.

De manera tradicional, la caracterización microbiana de los productos lácteos se ha realizado con técnicas dependientes de cultivo utilizando utilizando medios ricos no selectivos, combinados con recuentos en medios selectivos y diferenciales. De esta forma se lleva a cabo la enumeración y seguimiento de las poblaciones microbianas tecnológicamente relevantes y otras poblaciones indicadoras. En las últimas décadas, en estas caracterizaciones microbionas se ha comenzado a aplicar también una amplia variedad de técnicas moleculares independientes de cultivo (Giraffa y Neviani, 2001; Jany y Barbier, 2008). Estas técnicas han revelado una diversidad microbiana muy superior a la que anticiparon las técnicas de cultivo.

Los métodos moleculares permiten evitar algunos de los inconvenientes asociados al cultivo microbiano como la baja especificidad de los medios selectivos y la imposibilidad de detectar células viables pero no cultivables. La mayor parte de estos nuevos métodos se basan en la amplificación de ADN o ARN ribosómico mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y un posterior análisis de los amplicones obtenidos (Amman y col., 1995). Estas técnicas son menos laboriosas, más fiables, más rápidas y más baratas que las técnicas convencionales de cultivo. Además ofrecen una descripción microbiana más completa de los ecosistemas alimentarios. Sin embargo, como señalan varios autores, no están libres de inconvenientes y limitaciones que es necesario conocer para una mejor interpretación de los resultados (von Wintzingerode y col., 1997; Ercolini, 2004).

4.1. Microbiología convencional de quesos tradicionales españoles

Numerosos quesos tradicionales españoles se han analizado en el pasado por medio de las técnicas de cultivo. Las técnicas microbiológicas clásicas utilizadas en los estudios pioneros sobre el queso Cabrales (Núñez, 1978), el queso Manchego (Ordóñez y col., 1978), el queso de La Serena (Del Pozo y col., 1988) y otros (Fontecha y col., 1990), se han continuado utilizando hasta el presente. Las técnicas

de cultivo además son indispensables para la obtención de cepas que, una vez identificadas y caracterizadas, se puedan utilizar como fermentos. De esta forma, desde los años 90 se han caracterizado microbiológicamente los quesos de La Armada (Tornadijo y col., 1995), Afuega’l Pitu (Cuesta y col., 1996), Arzúa (Centeno y col., 1996), Peñamellera (Estepar y col., 1999), queso de cabra de Tenerife (Zarate y col., 1997), el queso Cabrales (Flórez y col., 2006), el queso Manchego (Ballesteros y col., 2006) y otros muchos. El objetivo de todos estos estudios es conocer la composición y diversidad microbiana de los quesos tradicionales y su evolución a lo largo de la maduración. Este conocimiento podrá emplearse para mejorar la calidad organoléptica e higiénica de estos productos. Los trabajos se dirigen también a preservar la microbiota tecnológicamente relevante con el fin de elaborar fermentos específicos para los distintos quesos, o para utilizar sus componentes en otras aplicaciones biotecnológicas.

4.2. Estudios microbiológicos independientes de cultivo

Con la implantación de las técnicas moleculares independientes de cultivo, en los últimos años, se ha profundizado aún más en el conocimiento de la composición y estructura de las poblaciones que gobiernan las fermentaciones lácteas y en la dinámica de estas a lo largo de la maduración. Estas técnicas se han aplicado ya al estudio del queso de Cabrales (Flórez y Mayo, 2006) y a algunos quesos tradicionales de Andalucía como el de Cueva de la Magahá (Martín-Platero y col., 2008) o el de Sierra de Aracena (Martín-Platero y col., 2009). Entre las técnicas independientes de cultivo que se han empleado en estas caracterizaciones podemos destacar la DGGE (Flórez and Mayo, 2006; Capítulo 3 de esta memoria), la LH-PCR (Martín-Platero y col., 2008; Martín-Platero y col., 2009) y la pirosecuenciación (Capítulo 5 de esta memoria).

4.2.1. Electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)

La electroforesis en gel con gradiente químico desnaturalizante (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis o DGGE) y su técnica gemela, la electroforesis en gel con gradiente temporal de temperatura (TTGE), se desarrollaron con el fin de analizar comunidades microbianas. Ambas se basan en una migración secuencia-específica de amplicones de un gen polimórfico (como por ejemplo el que codifica el ARNr

16S) obtenidos mediante PCR, a través de un gel con un gradiente desnaturalizante (Muyzer y Smalla, 1998). La separación de los amplicones en la electroforesis se basa en una reducción de movilidad de la doble hélice de ADN a medida que se va desnaturalizando a su paso por el gel de poliacrilamida con el gradiente (sea químico o de temperatura). Con el objetivo de prevenir la completa disociación de las dos moléculas de la doble cadena, se añade al extremo 5’ de uno de los cebadores una secuencia de citosinas y guaninas (denominada pinza GC) de alrededor de 50 bases. Ambas técnicas (PCR-DGGE y PCR-TTGE) han sido usadas recientemente en estudios microbiológicos de la leche y diferentes tipos de quesos (Coppola y col., 2001; Ogier y col., 2002; Randazzo y col., 2002; Ercolini y col., 2004; Ogier y col., 2004). Con ellas se pueden analizar las poblaciones mayoritarias de una forma rápida y sencilla (Muyzer y col., 1993). Si en vez de ADN se analiza el ARN microbiano total, los perfiles de DGGE revelan las poblaciones mayoritarias y metabólicamente activas.

Figura 6. Esquema simplificado del funcionamiento de la DGGE. 6A:Diseño de la amplificación por PCR. Uno de los dos oligos lleva unida una pinza GC para evitar la completa desnaturalización del amplicón. 6B: Tras la amplificación se obtiene una mezcla de amplicones con distinta secuencia pero mismo tamaño que dan una única banda en un gel de agarosa convencional. 6C: Los amplicones se desnaturalizan en función de su secuencia, debido a que las bases GC tienen uniones más fuertes. 6D: La electroforesis se realiza en presencia de un agente desnaturalizante. La desnaturalización del amplicón hace que este migre menos a través del gel de acrilamida.

4.2.2. LH-PCR

LH-PCR hace referencia a la heterogeneidad de longitud en una amplificación por PCR (length heterogeneity-PCR). Uno de los genes con mayor significado en ecología microbiana, es el que codifica el ARNr 16S (Suzuki y col., 1998). Este gen tiene regiones muy conservadas en todos los grupos de procariotas separadas por regiones hipervariables que son distintas entre grupos, géneros y especies. Las regiones hipervariables se pueden amplificar en conjunto o por separado con distintos cebadores. Lo que se registra mediante esta técnica es la diferencia de longitud del amplicón (sea de uno o de varios segmentos del gen o del gen completo) tras una amplificación utilizando cebadores fluorescentes, seguida de una electroforesis capilar. La técnica LH-PCR se ha utilizado para analizar la composición y evolución de los lactobacilos en quesos tradicionales andaluces (Martín-Platero y col., 2008; Martín-Platero y col., 2009).

4.2.3. Nuevas técnicas de secuenciación

Las nuevas técnicas de secuenciación o NGS (Next Generation Sequencing) engloban a un grupo de tecnologías que permiten una secuenciación masiva simultánea de muchos fragmentos de ADN. Las técnicas NGS son de gran utilidad para el estudio de la composición, estructura y evolución de las poblaciones microbianas. Las dos principales tecnologías utilizadas hasta la fecha son el Pirosecuenciador 454 de LifeScience (Roche) y la plataforma de secuenciación Illumina (Illumina Company). Ambos sistemas tienen un rendimiento infinitamente superior a los secuenciadores capilares tradicionales. En general, la pirosecuenciación consigue secuencias más largas (hasta las 600 pares de bases), mientras que la tecnología Illumina presenta unos costes inferiores y supera a la tecnología 454 en número de secuencias obtenidas por reacción (109 _{con el equipo}

HiSeq2000 de Illumina frente a 106 _{con el equipo 454FLX+). El análisis de una}

secuencia más larga es más fiable desde el punto de vista taxonómico. Sin embargo algunos autores defienden que 150 pares de bases localizadas en regiones hipervariables son suficientes para identificar la mayor parte de las especies microbianas (Liu y col., 2007).

La pirosecuenciación fue la primera de las tecnologías NGS disponible en el mercado y ha sido la opción mayoritaria para el estudio de poblaciones microbianas en alimentos. En lácteos, esta técnica se ha utilizado para el estudio de las poblaciones microbianas asociadas al kéfir, (Dobson y col., 2011; Leite y col., 2012), a quesos daneses (Masoud y col., 2011), a la Mozzarella (Ercolini y col. 2012) a queso de tipo latino (Lusk y col. 2012) y los microorganismos presentes en quesos irlandeses tradicionales (Quigley y col., 2012). La técnica se ha aplicado también en la caracterización microbiológica del queso Oscypek que se relaciona en esta memoria (Primera parte, Artículo III).