Sensitivity to Lower Boundary Conditions

El segundo periodo de experimentación se realizó en la Facultad de Ciencias Agropecuarias y el Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP) de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, para determinar el efecto de diferentes aislados de

Rhizobium sobre parámetros morfológicos, fisiológicos y la fijación de N en dos genotipos

contrastantes de frijol común, BAT-304 e ICA Pijao en condiciones controladas.

Tabla 5.1 Genotipos de frijol común utilizados en el ensayo y sus principales características

Genotipos de frijol

común

Características relevantes Proveedor de las semillas Ciclo (días) Tipo de crecimiento* Color grano Masa vainas (g) Rdto. bajos insumos (t ha-1₎

ICA Pijao 82 II Negro 7.82 0.65 AgroFAR VC BAT-304 75 III Negro 9.68 0.70 AgroFAR VC

* tipo de crecimiento indeterminado sin habilidad de trepar (Voysest, 2000)

5.2.1 Preparación del inoculó, montaje del experimento e inoculación

Cepas bacterianas

Las cepas bacterianas utilizadas en el ensayo fueron aquellas caracterizadas morfológicamente e identificadas genéticamente, sin embargo, solo se inocularon aquellas que fueron capaces de formar nódulos en las raíces de frijol común (var. BAT-477)

Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium: comportamiento en genotipos de frijol 28

mediante un ensayo preliminar de re-inoculación. La tabla 5.2 muestra las cepas utilizadas en el experimento en condiciones controladas, así como el la zona de muestro donde se aislaron estas bacterias.

Tabla 5.2 Cepas bacterianas utilizadas en el ensayo en condiciones controladas

Identificador Identificación genética

Zona de aislamiento

R-40979 Rhizobium pisi Cifuentes (Unidad Proletaria)

R-40980 Rhizobium pisi Cienfuegos (Lajas)

R-40981 Rhizobium etli Santa Clara (Carretera de Maleza)

R-40982 Rhizobium pisi Sagua la Grande (Jesús Menéndez)

R-40983 Rhizobium pisi Camajuaní (campesino Camajuaní)

R-43451 Rhizobium etli Camajuaní (campesino Camajuaní)

CNPAF-512 Rhizobium etli Cepa tipo (wild type)

Preparación del inoculo, montaje del experimento e inoculación

El crecimiento de las cepas se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Agropecuarias. Todas las cepas utilizadas se sembraron en medio Fred sólido (Manitol 10g; MgSO47H2O 0.2g; NaCl 0.1g; CaCO3 0,5g; K2HPO4 0.5g; Extracto de

levadura 0.5g; Agar 15g; esto para 1L) durante 72 h e incubadas a 30 ºC. Para la preparación del pre-inóculo se dispuso de 10 ml de medio Fred modificado y se ajustó el pH a 7 añadiendo HCl. En este medio se sembraron las cepas previamente crecidas. Los tubos se incubaron a 30 º_{C durante 24 h en incubadora zaranda (Gerhardt, THO-500,}

Alemania) para contar con título mínimo de 108 _{unidades formadoras de colonias por ml}

(ufc ml-1_{). Al cabo del tiempo establecido se inoculó el cultivo de cada cepa en 500 ml de}

medio Fred modificado para obtenerse el inóculo final, el cual se incubó a 30 ºC durante 24 h en incubadora zaranda.

Luego del tiempo necesario para el crecimiento de las bacterias se realizó el conteo de las células viables en cada una de los aislados. Todas las cepas contaron con títulos de 109 _o

1010 ufc ml-1 para la realización de la inoculación de las semillas.

En la fase de adaptación del IBP se realizó el ensayo, para el cual se dispuso de un diseño experimental totalmente aleatorizado con 10 réplicas por cada cepa objeto de

___________________________________________________________{Materiales y Métodos}

Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium: comportamiento en genotipos de frijol 29

análisis, además de un tratamiento control con la inoculación de la cepa tipo CNPAF-512 y un control sin inoculación de bacterias. Se depositaron 2 bandeja de poliespuma de 96 hoyos, de ellos solo se utilizaron para cada variedad un total de 80 hoyos, en los cuales se añadieron 200 gramos de zeolita inactiva como sustrato para el crecimiento de las plantas. En cada hoyo se sembraron las semillas de las variedades ICA Pijao y BAT-304, las que se inocularon con 5 ml de inóculo de cada cepa en el momento de la siembra. A las semillas del tratamiento control sin inoculación se les añadió 5 ml de agua.

5.2.2 Condiciones de crecimiento y evaluaciones

Las bandejas de poliespuma sembradas e inoculadas se colocaron en la cámara 5 de la casa de cultivo 1 del IBP, donde existía adecuada iluminación y se mantuvo el riego manual diario para evitar la desecación de la zeolita.

Durante todo el periodo de experimentación no se detectó presencia de plagas o enfermedades en las plantas de ambas variedades analizadas. Tampoco se fertilizó ni se aplicó producto químico alguno. Todos los hoyos donde crecieron las plantas se encontraban libre de malezas, por lo cual no se tuvo que realizar ningún tipo de labor cultural.

Evaluaciones

A partir de los 7 días de la siembra del experimento se evaluó la altura (cm) y el número de hojas de las plantas. Estas últimas evaluaciones se continuaron a los 15 y 21 días respectivamente.

A los 21 días después de la siembra (DDS) se analizaron los parámetros morfológicos y fisiológicos de la nodulación: número de nódulos totales (NN) y peso fresco y seco de los nódulos (PFN, PSN en gramos) (FAO, 1995); además del contenido de biomasa de la raíz y el follaje: peso fresco y seco de la raíz (PFR, PSR) y el peso fresco y seco del follaje (PFF, PSF en gramos). Para los análisis se cosecharon todas las plantas, por lo que se dispuso de 10 muestras por cada tratamiento. El análisis de la biomasa se realizó en balanza (Explorer Pro, EP64, Suiza)

Luego del análisis del contenido de materia seca mediante el secado de la parte aérea de las plantas, se precedió determinar la fijación de N para cada tratamiento tomando 2 réplicas como muestra. Este parámetro se realizó mediante el porcentaje de N total (% N total) y el porcentaje de proteína bruta (% PB). Para esta determinación se utilizó el

Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium: comportamiento en genotipos de frijol 30

método Kjeldahl, (citado por Herrera et al., 1980), el cual se basa en la transformación del

N contenido en la muestra en sulfato de amonio (Na2SO4) mediante la digestión con acido

sulfúrico H2SO4 en presencia de selenio (Se) como catalizador (Se 5g /1 L de H2SO4). El

ion amonio (NH4+) obtenido se transforma en medio básico (NaOH) al 32%) en amonio

(NH4) que se destila y valora con una solución de acido patrón (HCl 0.1 % N).

El cálculo del % N total se efectúa por la siguiente formula:

14 , 0 * % PM VB Vm N = − Donde:

%N= porcentaje de N total de la muestra Vm= volumen de la muestra

VB= volumen del blanco (H2SO4 sin muestra)

PM= peso de la muestra

Para el cálculo del contenido de proteína bruta (P.B) se siguió la siguiente formula:

25 , 6 * %N PB= Donde: PB= proteína bruta %N= porcentaje de N total 5.2.3 Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizándose el paquete STATGRAPHIC® _{Plus ver. 5.0}

para el sistema operativo Windows. Cada análisis se realizó teniendo en cuenta la normalidad de los datos a procesar.

Para determinar las diferencias estadísticas entre los tratamientos, las variedades o la interacción de estos factores en los parámetros de nodulación (NN, PFN, PSN) y la biomasa de las plantas (PFR, PSR, PFF, PSF), se realizó un análisis de varianza multifactorial (Multifactor ANOVA), donde se determinó el grado de independencia de los

tratamientos y las variedades, los cuales no tuvieron diferencias significativas en la interacción (p<0.05) para estas variables evaluadas. De este modo se realizó el análisis de varianza simple (One-Way ANOVA) y la prueba paramétrica Bonferroni con nivel de

___________________________________________________________{Materiales y Métodos}

Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium: comportamiento en genotipos de frijol 31

verificación de varianza para conocer la homogeneidad de estas y por consiguiente seleccionar la prueba paramétrica o no paramétrica idónea a utilizar.

Para las evaluaciones de la fijación de N no se realizó análisis estadístico ya que se analizo el porcentaje de N total y no las proporciones de fijación de N.

Para las diferencias entre variedades por tratamientos se realizó el análisis de comparación de dos muestras (Two-Samples Comparison) por columnas con nivel de

significación p<0.05.

Para correlacionar los parámetros de nodulación y la biomasa de las plantas se realizó un análisis de regresión lineal mediante coeficiente de correlación de Pearson (Pearson Linear Correlation) teniendo niveles de significación 0.01<p>0.05.

Caracterización e identificación de aislados de Rhizobium: comportamiento en genotipos de frijol 32