Resultados previos de nuestro grupo han demostrado que la ausencia de pRb conlleva una alteración de la homeostasis epidérmica debido a que ocasiona defectos en la proliferación y la diferenciación de los queratinocitos (Ruiz, Santos et al. 2004). Sin embargo, estos defectos resultan insuficientes para producir un desarrollo tumoral espontáneo, esto se debe a la compensación funcional ejercida por parte de p107, uno de los miembros de la familia de Retinoblastoma. Esta compensación va acompañada de un aumento de los niveles de esta proteína, alterando sus funciones (Lara, Santos et al. 2008). Se sabe además, que los ratones deficientes en p21 no manifiestan alteraciones epidérmicas (Paramio, Segrelles et al. 2001). Por otra parte, datos de expresión génica global obtenidos previamente en nuestro grupo, a partir de queratinocitos primarios procedentes de epidermis de ratones pRb∆Epi,
mostraban una inducción del gen Cdkn1a (p21) (Lara, Garcia-Escudero et al. 2008, Lara, Santos et al. 2008). Se han descrito múltiples funciones de p21 entre otras, el control de la proliferación en ausencia de pRb (Dimri, Nakanishi et al. 1996). Esto indicaría que en ausencia de pRb, p21 podría estar ejerciendo una función compensatoria en la epidermis limitando la proliferación de los queratinocitos.
Para comprobar esta hipótesis, se planteó el estudio de los efectos que produce la eliminación de pRb en la epidermis de animales deficientes en p21 (pRb∆Epi;p21-/-). Estos animales se obtuvieron cruzando ratones pRb∆Epi con ratones p21-/- (ver Materiales y
Métodos). En primer lugar, se comparó el fenotipo de los ratones pRb∆Epi;p21-/- con los ratones control, pRb∆Epi y p21-/-. Los ratones pRb∆Epi;p21-/- nacían con la frecuencia mendeliana esperada, pero al poco tiempo de nacer mostraban alteraciones fenotípicas importantes: tamaño reducido, apariencia frágil, descamación (hiperqueratosis) (Fig. 1A), alopecia (la pérdida de pelo es más acusada en cara y hocico) (Fig. 1A, B) generación espontánea de heridas (Fig. 1C) y microftalmia (Fig. 1D). No se observó ninguna de estas anomalías en los ratones del resto de los genotipos estudiados. Además, en comparación con los animales control, pRb∆Epi, y p21-/-, el peso de los ratones pRb∆Epi;p21-/- era menor, y aunque la diferencia se mantenía a lo largo de toda la vida del animal era más acusada durante las primeras semanas tras el nacimiento (Fig. 1E).
Asimismo, se evaluó la supervivencia de los ratones pRb
tres grupos en estudio, monitorizando un conjunto representativo de 32 ratones por genotipo durante un año. Los animales pRb
reducida, registrándose una tasa de mortalidad entorno al 80% durante las primeras 13 semanas de vida (Fig. 1F).
Fig.1. Apariencia, peso y supervivencia en los raton
días control, pRb∆Epi, p21-/- y pRb∆Epi Heridas espontáneas del ratón pRb
frente a la edad (días) de los cuatro genotipos en estudio. El análisis estadístico se hizo mediante ANOVA de dos vías. F) Curva Kaplan Meier mostrando la supervivencia global de los genotipos citados. El valor p fue o
el test Log rank.
Con objeto de comprobar si, como en el caso de los animales pRb
pRb∆Epi;p21-/- se producía un aumento de los niveles de alguna de las proteínas miembro de la familia de Retinoblastoma (p107 ó p130), se analizaron sus niveles a partir de extractos de proteínas procedentes de queratinocitos primarios de los cuatro grupos en est
western blot. Se comprobó que la ausencia de pRb ocasionaba un incremento de los niveles de p107, y p21 (Fig. 2). Estos resultados confirman los obtenidos previamente en queratinocitos Asimismo, se evaluó la supervivencia de los ratones pRb∆Epi;p21-/- frente a los otros
tres grupos en estudio, monitorizando un conjunto representativo de 32 ratones por genotipo durante un año. Los animales pRb∆Epi;p21-/- presentaron una supervivencia severamente reducida, registrándose una tasa de mortalidad entorno al 80% durante las primeras 13
Fig.1. Apariencia, peso y supervivencia en los ratones pRb∆Epi;p21-/-. A) Aspecto macroscópico de ratones de 30
∆Epi
;p21-/-. B) Detalle de la cabeza y hocico mostrando la pérdida de pelo. C) Heridas espontáneas del ratón pRb∆Epi;p21-/-. D) Microftalmia. E) Curva representando la ganancia de peso (g) frente a la edad (días) de los cuatro genotipos en estudio. El análisis estadístico se hizo mediante ANOVA de dos vías.
Curva Kaplan Meier mostrando la supervivencia global de los genotipos citados. El valor p fue o
Con objeto de comprobar si, como en el caso de los animales pRb∆Epi
se producía un aumento de los niveles de alguna de las proteínas miembro de la familia de Retinoblastoma (p107 ó p130), se analizaron sus niveles a partir de extractos de proteínas procedentes de queratinocitos primarios de los cuatro grupos en est
. Se comprobó que la ausencia de pRb ocasionaba un incremento de los niveles de p107, y p21 (Fig. 2). Estos resultados confirman los obtenidos previamente en queratinocitos
64 frente a los otros tres grupos en estudio, monitorizando un conjunto representativo de 32 ratones por genotipo presentaron una supervivencia severamente reducida, registrándose una tasa de mortalidad entorno al 80% durante las primeras 13
A) Aspecto macroscópico de ratones de 30 . B) Detalle de la cabeza y hocico mostrando la pérdida de pelo. C) representando la ganancia de peso (g) frente a la edad (días) de los cuatro genotipos en estudio. El análisis estadístico se hizo mediante ANOVA de dos vías. Curva Kaplan Meier mostrando la supervivencia global de los genotipos citados. El valor p fue obtenido mediante
∆Epi, en los animales
se producía un aumento de los niveles de alguna de las proteínas miembro de la familia de Retinoblastoma (p107 ó p130), se analizaron sus niveles a partir de extractos de proteínas procedentes de queratinocitos primarios de los cuatro grupos en estudio, mediante . Se comprobó que la ausencia de pRb ocasionaba un incremento de los niveles de p107, y p21 (Fig. 2). Estos resultados confirman los obtenidos previamente en queratinocitos
65 primarios y epidermis de ratones deficientes en pRb∆Epi (Lara, Garcia-Escudero et al. 2008, Lara,
Santos et al. 2008, Costa, Paramio et al. 2013). Al igual que los queratinocitos pRb∆Epi, los
queratinocitos pRb∆Epi;p21-/- mostraron un incremento de p107, del factor de transcripción E2F1 y del supresor tumoral p53, (Lara, Garcia-Escudero et al. 2008, Lara, Santos et al. 2008) sin que la pérdida adicional de p21 incrementase más los niveles de estas proteínas.
Como cabía esperar, no se detectó pRb en los queratinocitos pRb∆Epi ni en los
queratinocitos pRb∆Epi;p21-/-, en los que tampoco se detectó p21 (Fig. 2).
Fig 2. Western blot representativo de extractos proteicos de queratinocitos primarios de ratón de los genotipos citados mostrando la expresión de las proteínas mencionadas. Cada línea contiene una
mezcla de extractos proteicos de queratinocitos de la epidermis de tres ratones. El número situado debajo de cada banda indica el valor densitométrico de cada banda normalizada de acuerdo a su valor correspondiente de Actina.
Para profundizar en las consecuencias de la ausencia conjunta de pRb y p21 en la epidermis, se realizó un análisis histopatológico de pieles de animales a 10 días post- nacimiento (P10), procedentes de los cuatro grupos en estudio: control, p21-/-, pRb∆Epi y pRb∆Epi;p21-/-. El análisis histológico desveló que la epidermis de un ratón control (Fig. 3A) y la de un ratón p21-/- (Fig. 3B) eran indistinguibles y no presentaban ninguna alteración apreciable, lo que confirma las observaciones previas (Paramio, Segrelles et al. 2001). La epidermis de un ratón pRb∆Epi mostraba hiperplasia (incremento en el número de capas celulares) e hiperqueratosis (engrosamiento del estrato córneo) moderadas (Fig. 3C), tal y como estaba descrito previamente (Ruiz, Santos et al. 2004). Estas alteraciones se agudizaban profundamente con la pérdida adicional de p21. La epidermis del ratón pRb∆Epi;p21-/-,
presentaba hiperplasia e hiperqueratosis severa, distrofia de los folículos pilosos con glándulas sebáceas aisladas e hipertróficas (Fig. 3D). Además, en piel de animales a 30 días post- nacimiento (P30) se detectó presencia de infiltrados inflamatorios masivos (Fig. 3E) y de
66 células nucleadas en el estrato córneo (paraqueratosis) (detalle señalado con flechas (Fig. 3E), lo que es indicativo de alteraciones en el proceso de la diferenciación terminal epidérmica. Ninguna de estas alteraciones se observaron en las epidermis de los animales control, p21-/- y pRb∆Epi.
Fig. 3. Fenotipo epidérmico de los ratones pRb∆Epi;p21-/-. A-E) Secciones histológicas representativas de la piel de
ratones a P10 control (A), p21-/- (B), pRb∆Epi (C) y pRb∆Epi;p21-/- (D) y piel de ratón pRb∆Epi;p21-/- a P30 (E) teñidas con hematoxilia y eosina. Nótese el fenotipo epidérmico en los ratones pRb∆Epi;p21-/- caracterizados por hiperplasia, hiperqueratosis y paraqueratosis (detalle en E), e infiltrados celulares en la dermis (E).