Debido a los resultados anteriores quisimos comprobar si el estrés replicativo observado en las células epidérmicas, como consecuencia de ausencia de pRb y p21, podría estar conduciendo en último término a su muerte. Para comprobarlo se evaluó en primer lu la muerte por apoptosis. Para ello, se analizó la expresión de p53,
un estrés replicativo y diferente de la tinción en algunos focos dispersos evidente en células sometidas a un daño genotóxico agudo (Toledo, Murga et al. , Cimprich and Cortez 2008) junto con el hecho de que la γH2AX se detecte predominante en las células suprabasales de la
RbΔEpi;p21-/-, apoyaría la hipótesis de que en estos animales la ausencia simultánea pRb y p21 en los queratinocitos provocaría su entrada en un programa de diferenciación sin haber detenido su proliferación, originando un estrés replicativo que produciría una acumulación de daño en el ADN.
Para confirmar si el daño era una consecuencia del estrés replicativo, se analiza niveles de proteínas de la vía ATR-Chk1, implicada en la respuesta a este tipo de daño (Cimprich and Cortez 2008, Lopez-Contreras and Fernandez-Capetillo 2010)
a partir de extractos de piel de los cuatro genotipos en estudio mostró niveles significativamente elevados de: p53 (Fig.27G, G’), ATR (Fig. 27G, G´´), Chk1-P (Fig. 27G, G´´´) y Chk1 (Fig. 27G, G´´´´) indicando una activación de la vía.
Fig. 27. El eje molecular del mecanismo de reparación de daño en el ADN está activado en la piel de los ratones
G) Análisis por western blot de los elementos de respuesta a daño en el ADN en la epidermis de los ratones de los cuatro genotipos citados. Cada línea corresponde a una muestra independiente. G´
densitométrico de las diferentes bandas y normalizadas de acuerdo a su valor correspondiente de Actina.
∆Epi
;p21-/- no muestran signos de apoptosis.
Debido a los resultados anteriores quisimos comprobar si el estrés replicativo observado en las células epidérmicas, como consecuencia de ausencia de pRb y p21, podría estar conduciendo en último término a su muerte. Para comprobarlo se evaluó en primer lu la muerte por apoptosis. Para ello, se analizó la expresión de p53, por inmunohistoquímica, en
92 un estrés replicativo y diferente de la tinción en algunos focos dispersos evidente en células (Toledo, Murga et al. , Cimprich and Cortez 2008). Esto, en las células suprabasales de la , apoyaría la hipótesis de que en estos animales la rovocaría su entrada en un programa de diferenciación sin haber detenido su proliferación, originando un estrés replicativo que
Para confirmar si el daño era una consecuencia del estrés replicativo, se analizaron los Chk1, implicada en la respuesta a este tipo de daño Capetillo 2010). El análisis por piel de los cuatro genotipos en estudio mostró niveles P (Fig. 27G, G´´´) y
reparación de daño en el ADN está activado en la piel de los ratones
G) Análisis por western blot de los elementos de respuesta a daño en el ADN en la epidermis de los estra independiente. G´-G´´´´) Análisis densitométrico de las diferentes bandas y normalizadas de acuerdo a su valor correspondiente de Actina.
no muestran signos de apoptosis.
Debido a los resultados anteriores quisimos comprobar si el estrés replicativo observado en las células epidérmicas, como consecuencia de ausencia de pRb y p21, podría estar conduciendo en último término a su muerte. Para comprobarlo se evaluó en primer lugar inmunohistoquímica, en
93 piel (Fig. 27G, G´ y 28A) y en lesiones tumorales (Fig. 28B) de los animales RbΔEpi;p21-/-. Sin
embargo, pese a la inducción de p53 observada en ambos casos, no se detectó Caspasa 3 activa ni en la piel (Fig. 28A´, C), ni en las lesiones tumorales (Fig. 28B´), de los ratones RbΔEpi;p21-/-, así como tampoco se detectó activación de Parp (Fig. 28C), que confirmasen un proceso apoptótico.
Fig. 28. Los animales Rb∆Epi;p21-/- no manifiestan signos de apoptosis. A-B´) Ejemplos de detección por
inmunohistoquímica de p53, en piel (A) o lesiones tumorales (B) de Rb∆Epi;p21-/-, y Caspasa 3 activa, en piel (A´) o en lesiones tumorales (B´). Barras=50µm. C) Análisis por western blot de Caspasa 3 activa y Parp en extractos proteicos de piel de ratón adulto de los genotipos citados. Las líneas situadas a la derecha del panel indican el peso molecular en kDa. La flecha señala el “control positivo” perteneciente a un extracto proteico de queratinocitos orales de ratón de la cepa FVB silvestre, tratados con una droga inductora de apoptosis. Las flechas a la izquierda señalan los fragmentos de Caspasa 3 activa y Parp. Se utilizó Actina como proteína normalizadora de la carga.
Las células dañadas por estrés replicativo son eliminadas predominantemente por un sistema alternativo de muerte distinto de la apoptosis, denominado “catástrofe mitótica”. Este mecanismos de muerte celular es el resultado de una prematura o inadecuada entrada en mitosis de las células que genera cromosomas sin replicar en esta fase del ciclo celular (Vakifahmetoglu, Olsson et al. 2008). En base a esto, analizamos la presencia de mitosis aberrantes y catástrofes mitóticas en secciones de piel de 5-10 animales por genotipo. Únicamente encontramos estas aberraciones en los animales RbΔEpi;p21-/-, detectando mitosis aberrantes y catástrofes mitóticas en zonas no tumorales de la epidermis (Fig. 29A-A´´ y C, señaladas por flechas). Estas mitosis aberrantes se detectaban también con frecuencia en los tumores (Fig. 29B). La Fig. 29C muestra la cuantificación de estas aberraciones por mm de epidermis en relación al número total de mitosis. Los datos confirmaron el aumento relevante de estas aberraciones mitóticas en los animales RbΔEpi;p21-/-.
94 Fig. 29. Las células epidérmicas dañadas de las pieles RbΔEpi;p21-/- son eliminadas por catástrofe mitótica. A-A´´´)
Ejemplos de mitosis aberrantes (marcadas con flechas) observadas en piel no tumoral del ratón RbΔEpi;p21-/-. B) Ejemplo de mitosis aberrantes en tumores espontáneos del ratón RbΔEpi;p21-/-. C) Ejemplo de catástrofes mitóticas (señaladas con flechas) observadas en piel no tumoral del ratón RbΔEpi;p21-/-. Barras=10µm. D) Resumen de mitosis normales, aberrantes y catástrofes mitóticas en la epidermis de los cuatro genotipos citados. Los datos proceden del análisis de secciones de piel de entre cinco y diez ratones de cada genotipo y son representadas como el promedio de mitosis aberrantes y catástrofes mitóticas por mm de epidermis.
En su conjunto, estos resultados indican que la pérdida de simultánea pRb y p21 en la epidermis, produce una desregulación génica que afecta a vías de señalización relacionadas con la homeostasis y la tumorigénesis epitelial. Además, ocasiona un aumento de células con daño en el ADN debido al estrés replicativo que se produce. Estas alteraciones, unidas a la inflamación detectada en estos animales, podrían explicar el desarrollo de los tumores espontáneos observados.
95
3.- Los ratones Rb
ΔEpi;p21-/- representan un modelo para el
estudio de los tumores orales.
Los carcinomas orales, presentan una elevada prevalencia con más de 6.000 casos nuevos diagnosticados en España en 2012, estimándose un incremento del 21% para el 2020. Más del 90% de estos tumores son CCEs (Globocan 2012). Sin embargo, a pesar de los últimos avances en cuanto a la terapia de esta enfermedad la supervivencia global de los pacientes con CECyC es todavía baja. Actualmente, existen pocos modelos animales que recapitulen el desarrollo de esta patología por tanto, la posibilidad de contar con un modelo de ratón de desarrollo de CCEs orales se convierte en una herramienta muy útil para la identificación de posibles dianas terapéuticas.
3.2. Los genes desregulados en las pieles de ratón Rb
ΔEpi;p21-/- muestran
similitudes con el transcriptoma de CECyC humano.
El desarrollo de CCEs observado en los tejidos orales de los ratones RbΔEpi;p21-/- junto con los datos obtenidos en el análisis por GSEA, en los que se observaba un enriquecimiento significativo de los genes desregulados en los animales RbΔEpi;p21-/- con datos de expresión
génica procedentes de diversos estudios realizados a partir de CECyC humanos (Tabla 4, Anexo 3 y Anexo 4), planteó la posibilidad de validar a los ratones RbΔEpi;p21-/- como un posible modelo de carcinomas orales. Para ello, se compararon los genes con expresión aumentada en los ratones RbΔEpi;p21-/-, con firmas de CECyC obtenidas en diversos estudios genómicos en los que se compara tejido tumoral frente a tejido normal, depositadas en la base Oncomine (Rhodes, Yu et al. 2004, Rhodes, Kalyana-Sundaram et al. 2007). La comparativa se realizó utilizando el test de Fisher’s considerando un Odds ratio >1,5 y un valor p≤0,01. El resultado reveló un solapamiento significativo entre los ARNm con expresión aumentada en las epidermis de ratón recién nacido RbΔEpi;p21-/- y los ARNm homólogos con expresión aumentada presentes en los estudios de Oncomine (Tabla 5). Estos resultados indicarían que los ratones RbΔEpi;p21-/- podrían representar un modelo para el estudio de los carcinomas
96
Tabla 5. Solapamiento entre los genes con expresión aumentada en la piel de recién nacido del ratón RbΔEpi;p21-/- y en CECyC humanos. La tabla muestra el número de genes que solapan significativamente entre los genes con expresión aumentada en la piel de los ratones RbΔEpi;p21-/- y CECyC humanos, donde se compara tejido tumoral frente a tejido normal.
Referencia del estudio Criterio: tumor vs tejido normal Número de genes
solapantes Valor p
(Pyeon, Newton et al. 2007) Carcinoma de lengua vs normal 155 9,03E-15
(Giordano, Au et al. 2006)
Carcinoma papilar de la glándula tiroides variante de célula alta vs normal
133 1,48E-11
(Giordano, Au et al. 2006) Carcinoma papilar de la glándula
tiroides vs normal 133 1,48E-11
(Ginos, Page et al. 2004) Carcinoma celular escamoso de
cabeza y cuello vs normal 125 3,70E-09
(Giordano, Au et al. 2006) Carcinoma papilar de la glándula
tiroides variante folicular vs normal 121 4,58E-08
(Pyeon, Newton et al. 2007) Carcinoma orofaríngeo vs normal 131 8,74E-08
(Giordano, Au et al. 2006)
Carcinoma (Anaplásico) indiferenciado de la glándula tiroides vs normal
116 8,40E-07
(Pyeon, Newton et al. 2007) Carcinoma del suelo de boca vs
normal 124 3,56E-06
(Estilo, P et al. 2009) Carcinoma celular escamoso de
lengua vs normal 92 1,25E-05
(Pyeon, Newton et al. 2007) Carcinoma de cavidad oral vs
normal 121 1,51E-05
(Talbot, P et al. 2004) Carcinoma celular escamoso de
lengua vs normal 91 2,16E-05
(He, Jazdzewski et al. 2005) Carcinoma papilar de glándula
tiroidea vs normal 119 3,76E-05
(Frierson, El-Naggar et al. 2002) Carcinoma cístico Adenoide de
glándula salivar vs normal 89 5,73E-05
(Ye, Yu et al. 2008) Carcinoma celular escamoso de
lengua vs normal 117 9,03E-05
(Sengupta, den Boon et al. 2006) Carcinoma nasofaríngeo vs normal 113 4,61E-04
(Schlingemann, Habtemichael et al. 2005)
Carcinoma celular escamoso
hipofaríngeo vs normal 102 6,85E-04
(Giordano, Au et al. 2006) Adenoma folicular de la glándula
97