Solution Corrosivity found from Electrochemical Tests

La estimación de la fecundidad se llevó a cabo siguiendo los métodos gravimétrico (Holden y Raitt, 1974) y de análisis de imágenes descrito por Kilbansky y Juanes (2008). En el método gravimétrico se realizaron algunas modificaciones a saber: las muestras fijadas en formol 10% se retiraron de los frascos, se pesaron y se les extrajo una submuestra (realizando un corte transversal) que correspondía al 10% del peso de la muestra, registrando el peso exacto mediante una balanza Sartorius BP210 S con precisión de 0,001. En total resultaron tres submuestras por cada gónada analizada correspondientes a las tres zonas: anterior, media y posterior (en adelante A, M y P) del peso establecido (Figura 9).

1. 2. A P A P P A

“Teniendo en cuenta que en fecundidad se estima el número de “huevos” que se encuentran en la gónada, y por supuesto estos no han sido ovulados, se habla de oocitos y no de huevos porque este es el estado anterior a la ovulación” (Murua y Saborido-Rey, 2003).

Para separar los oocitos, se ensayó inicialmente el reactivo Gilson (880 ml agua destilada, 100 ml de alcohol 60%, 18 ml ácido acético glacial, 15 ml de ácido nítrico y 20 g de cloruro de mercurio -HgCl2-), tradicionalmente empleado en la mayoría de

trabajos de fecundidad. De esta forma, las submuestras se almacenaron inicialmente en frascos de 25 ml con dicho reactivo, pero el avance en el trabajo utilizando Gilson no fue muy satisfactorio, en primer lugar porque no resultaba muy agradable su preparación y manipulación, ya que contiene cloruro de mercurio un químico altamente tóxico, y por otra parte se lograba una separación de oocitos apenas parcial en mucho tiempo (aproximadamente dos meses). De tal manera, se decidió utilizar otro compuesto, el hipoclorito de sodio 1%, un reactivo empleado por Vieira et al. (1999) en el estudio de la fecundidad de Colossoma macropomum en Brasil. La utilización de este reactivo, permitió la disociación de oocitos en una hora con previa manipulación manual de la submuestra, y la visualización de estos era mucho más clara bajo el estereoscopio (Figura 9).

Al lograr la separación de los oocitos, se extrajeron de los frascos con hipoclorito 1% utilizando un micropipeta plástica de 3 ml, y se colocaron sobre un papel filtro para ser lavados con agua destilada. Posteriormente, sobre una placa Bogorov se procedió con el conteo y medición de los mismos (Figura 10).

Inicialmente, se había propuesto contar los oocitos bajo el estereoscopio y medirlos utilizando un micrómetro ocular de 0,01 mm de precisión, pero dada la porción de gónada analizada (10% del peso total) y la gran cantidad de oocitos contenidos, se efectuó un método más práctico. Este consistía en la utilización del software IMAGE J (Abramoff et al.,2004) con un proceso similar al desarrollado por Gil-Manrique (2008).

Este programa permite analizar y procesar imágenes, y dentro de sus aplicaciones, se encuentra la estimación de áreas y longitudes, cumpliendo con las características para estimar el número y diámetro de oocitos (Anexo A).

Figura 9. Esquema general del tratamiento de muestras. 1. Ovario maduro (IV) y completo de C. crysos. A,M,P:

secciones anterior, media y posterior del ovario izquierdo luego de su preservación en formol 10%. 2. Peso de la sección posterior. 3. Peso de la submuestra de la sección posterior (10% peso sección). 4. Vista ampliada de la imagen 3. 5. Submuestra posterior en hipoclorito de sodio 1%. 6. Vista ampliada de la imagen 5 (oocitos en separación).

Formol 10% 1 3 A M P 2 4 Repetir pasos 2 al 5 Repetir pasos 2 al 5 5 6 Hipoclorito de sodio 1%

Teniendo entonces los oocitos sobre la cámara Bogorov, se esparcían bien con la ayuda de una aguja de disección, sin dejar que quedara uno sobre otro, y se tomaban varias fotos: unas de toda la placa que eran utilizadas para el conteo (la cantidad de fotos era tal que correspondiera con el número de placas utilizadas para revisar toda la muestra, pues en la mayoría de casos, todos los oocitos no cabían en una sola placa) y otras de un cuarto de placa lo que permitía una mayor definición de los oocitos, lo que era indispensable para medirlos con Image J. Las fotografías se tomaron con una cámara digital SONY DSC-S85 (Figura 10).

En últimas, el programa Image J fue utilizado sólo para medir los oocitos no para contarlos, puesto que primero, se debe tener la precaución de que estos no queden superpuestos o juntos, ya que el programa no discrimina entre un oocito o un conjunto de ellos, ambos los toma como una unidad, y segundo, era complicado que el programa sólo contara aquellos oocitos considerados viables (los más grandes, llenos de vitelo o muy amarillos y con forma definida) y descartara el resto. Era posible establecer un rango de tamaño para que el programa contara sólo los que estuvieran dentro de él, pero se consideró que el tamaño no era la única característica determinante de la viabilidad de los oocitos.

De manera que resultó más sencillo tomar una sola foto de toda la placa con los oocitos en ella, sin mayor trabajo de separación, y se procesó en Paint, programa en el que se contaron aquellos que se consideraban viables de acuerdo a las características antes mencionadas y con previo reconocimiento de estas bajo el estereoscopio.

La medida del diámetro se tomó en mínimo 300 oocitos por cada submuestra (A,M,P). Esta cantidad era suficiente para lograr un número representativo de mediciones de oocitos por individuo, de manera que bastaba con llenar únicamente una placa Bogorov con los oocitos que cupieran en ella para alcanzar dicha cantidad. Luego, se capturaba la fotografía y se medían con Image J. Se debía tener un patrón de medida dentro de la foto para luego determinar la escala de medida en el programa. En este caso se

utilizó una reglilla en milímetros. Se tomaban cuatro fotos correspondientes a cada extremo de la placa, pues de esta forma, se obtenían imágenes con mayor definición de los oocitos (Figura 10). Finalmente, luego de analizar las fotos con Image J, se tenía un listado de diámetros que el mismo programa facilitaba para dar paso al cálculo del diámetro geométrico (el proceso de análisis de fotos en Image J se describe en detalle en el Anexo A).

Figura 10. Modalidades de fotos empleadas para el conteo (1) y medición (2) de oocitos. 1. Foto de toda la placa Bogorov con oocitos de S. brasiliensis para ser analizada en Paint. 2. Foto de sólo un cuarto de placa con una reglilla en milímetros que sirve de patrón de medida para ImageJ.

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