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La información obtenida a partir del análisis simultáneo de proteínas y genes puede aprovecharse de manera efectiva para el estudio detallado de distintos procesos celulares a distintos niveles moleculares, permitiendo identificar variaciones fenotípicas entre subpoblaciones de células, por ejemplo, explorando todo tipo de respuestas celulares, algo

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enormemente útil desde el punto de vista diagnóstico y del diseño de tratamientos personalizados hacia distintas enfermedades [Darmanis, 2016].

Para llevar a cabo la detección de células madre cancerígenas en el interior de un tumor sólido puede ser suficiente el análisis de biomarcadores proteicos, cuya expresión se encuentra elevada en este tipo de células, conociendo a priori el tipo de neoplasia. Sin embargo, en otros tipos de muestras como la sangre, donde la disponibilidad de algunos marcadores proteicos celulares puede ser limitada, la detección de otros tipos de biomarcadores (además de los proteicos) puede incrementar de manera notable la sensibilidad, especificidad y eficiencia en la detección de células neoplásicas [Rhee, 2009].

Mientras que el papel de muchos de los biomarcadores proteicos del suero todavía debe ser elucidado con objeto de determinar su utilidad práctica real en el diagnóstico precoz de enfermedades, los biomarcadores circulantes de tipo DNA y RNA, presentan unas características genéticas idénticas a las de los tumores primarios. Así, aunque la mayor parte de las metodologías del campo de los biomarcadores clínicos estén enfocadas a la detección independiente de proteínas y ácidos nucleicos, la determinación combinada de ambos tipos de biomarcadores resulta tremendamente útil para el diagnóstico de enfermedades en las etapas más tempranas de su desarrollo y la estratificación y evaluación de respuestas a las terapias aplicadas, con una sensibilidad y especificidad de diagnóstico mejoradas [Mao, 2014], permitiendo que los especialistas elaboren perfiles o patrones de la enfermedad más precisos en base a la presencia, niveles de expresión y evolución de biomarcadores de distinto nivel, en función del tiempo.

En el caso particular del cáncer de mama, aunque la amplificación del gen HER-2 y la correspondiente hiperexpresión del receptor HER-2 ocurre en el 15–25 % de los casos, al igual que sucede en otros tipos de neoplasias, este cáncer puede presentar diversos grados de heterogeneidad en cuanto a la expresión y amplificación de receptor y gen, respectivamente

[Hirschmann, 2012]. Por ello, la detección simultánea de ambos biomarcadores en un único experimento puede considerarse una herramienta elegante, eficaz y de destacada utilidad para la ejecución de estos tipos de ensayos de rutina por parte de los especialistas.

Una vez más, las excelentes propiedades y características de los biosensores electroquímicos pueden ser aprovechadas para la detección múltiple de biomarcadores de distinto nivel molecular, en un único dispositivo y de una manera rápida y fiable.

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Los trabajos encontrados para la detección electroquímica simultánea de proteínas y marcadores genéticos relevantes en el desarrollo de neoplasias y asociados con el progreso y respuesta a tratamientos de las mismas se resumen en la Tabla 9.

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Tabla 9: Biosensores electroquímicos para la determinación multiplexada de biomarcadores de cáncer de naturaleza proteica y genética. Transductor

Soporte Estrategia Inmovilización Analito Técnica de detección Muestra Marcador LD Referencia

SiNW/APTES/GA- SAM SiNW-FET Reconocimiento directo DNA/miRNA anti-CEA-Ab/CEA

Enlace covalente entre grupos terminales de DNA y anti-CEA y GA-

SAM

CEA miRNA-126

Evaluación de los cambios de corriente en función del

tiempo Suero humano ----

CEA: 1 fg mL-1

miRNA-126: 0.1

fM [Gao, 2017]

AuE modificado con CP y NPs de dendrímero modificadas con estreptavidina AuE Hibridación directa DNA-IL-8 mRNA y formato tipo sándwich

para IL-8

Enlace por afinidad

(Estrep-biotina) IL-8 mRNAIL-8

Amperometría

(Eapp = –0.2 V vs. Au)

(TMB/H2O2)

Saliva de pacientes con cáncer oral

anti- fluoresceína-

HRP anti-IL-8-HRP

IL-8: 7.4 pg mL-1

IL-8 mRNA: 3.9 fM [Wei, 2009]

AuE modificados con nanoestructuras de DNA tetraédricas autoensambladas (TDNs) AuE

DNA: Formato tipo sándwich miRNAs: Hibridación del miRNA diana con sonda de captura de tipo horquilla y sonda

de detección modificada con biotina

Proteínas: Formato tipo sándwich Moléculas pequeñas: Reconocimiento efectivo entre aptámero y molecula diana Interacción Au–SH DNAs miRNA-21, miRNA-141 PSA, trombina Cocaína Células Amperometría (Eapp = +0.1 V vs. Ag/AgCl) (TMB/H2O2) Lisados celulares, extractos de tejidos y suero humano Avidina-HRP Estrep-poli-HRP Ab2-HRP DNA: 1 fM miRNA: 10 aM Moléculas pequeñas: 33 nM Proteínas: 500–1 pg mL-1 Células: 24 células [Lin, 2016]

Abreviaturas utilizadas:Ab: anticuerpo; Ab2: anticuerpo secundario: APTES: 3-aminopropiltrietoxisilano; AuNPs: nanopartículas de oro; CEA: antígeno carcinoembrionario; Cp: sonda de captura;

CP: polímero conductor; Estrep: estreptavidina; FET: transistor de efecto campo; GA: glutaraldehído; HRP: peroxidasa de rábano; IL-8: interleucina-8; IL-8 mRNA: RNA mensajero codificante de

la proteína IL-8; LD: límite de detección; miRNA: micro-RNA; NPs: nanopartícula; PSA: antígeno específico de próstata; SAM: monocapa autoensamblada; SH: grupo tiol; SiNWs: nanoalambres

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Wei y col., fabricaron un dispositivo capaz de determinar simultáneamente dos biomarcadores asociados con el desarrollo de cáncer oral en muestras de saliva: la proteína IL-8 y su mRNA correspondiente (IL-8 mRNA), empleando un array de 16 electrodos de oro

[Wei, 2009]. Cada unidad transductora se modificaba con un polímero conductor mediante electropolimerización y, con el objetivo de incrementar y mejorar la biocompatibilidad de la película polimérica, la matriz del mismo se modificaba con dendrímeros de nanopartículas modificadas con estreptavidina. Los elementos de reconocimiento selectivos tanto al biomarcador genético (secuencias de tipo horquilla funcionalizadas con biotina y fluoresceína en cada uno de sus extremos) y proteico (anticuerpos), se inmovilizaron sobre la superficie modificada de Au mediante la aplicación de ciclos de potencial a –0.3 V y +0.2 V, para, seguidamente, incubar con la muestra que contiene ambos analitos. En presencia de una mezcla de anticuerpos específicos a fluoresceína y a la proteína IL-8 marcados con HRP, se monitoriza la señal amperométrica debida a la presencia de cada biomarcador, en presencia de H2O2 y TMB. La aplicabilidad del dispositivo se llevó a cabo mediante el análisis de 56 muestras de saliva, incluyendo 28 muestras de pacientes diagnosticados con cáncer oral y 28 muestras control, demostrándose la presencia de ambas moléculas en las muestras de pacientes con cáncer y, por tanto, su papel como biomarcadores de este tipo de neoplasia. Esta estrategia proporcionó LDs de 3.9 fM y 7.4 pg mL-1 _{y valores de sensibilidad y} especificidad analítica de 83 % y 87 %, y 87 % y 87 %, para la determinación de mRNA y proteína, respectivamente, lo que pone de manifiesto la elevada precisión del método, comparable a las metodologías ELISA y PCR, sin necesidad de llevar a cabo ningún pretratamiento adicional de la muestra, como por ejemplo ciclos de descongelación y procesos de lisis (requeridos en ciertas ocasiones para la liberación de las moléculas de mRNA enlazadas a moléculas de mayor tamaño).

Otro de los trabajos destacables es el desarrollado por Lin y col., que propusieron una plataforma biosensora de carácter universal basada en nanoestructuras tetraédricas de DNA tiolados (TDNs) inmovilizadas sobre la superficie de electrodos de oro con gran reproducibilidad [Lin, 2016]. Estas estructuras tetraédricas, que muestran una excelente versatilidad funcional, pueden emplearse para la detección específica de todo tipo de biomoléculas multinivel mediante amperometría en presencia de H2O2 y TMB. Los autores demostraron que la variación del tamaño de las estructuras TDNs permite modular

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parámetros cinéticos y termodinámicos del reconocimiento molecular que tiene lugar entre TDNs y las distintas moléculas de interés, mediante la incorporación de toda una variedad de elementos de reconocimiento (DNA, aptámeros y anticuerpos), dispuestos en el vértice superior de la nanoestructura tetraédrica oligonucleotídica, dotando a la metodología de un carácter universal. Aunque la estrategia propuesta se aplicó a la determinación individual de distintos biomarcadores en lisados celulares, extractos tisulares y muestras de suero, no sería descartable su utilización como base fundamental de dispositivos con carácter multianalito para la determinación de un amplio panel de biomarcadores moleculares de manera efectiva, previa modificación de la superficie sensora con la nanoestructura tetraédrica de reconocimiento específica correspondiente.

En conjunto, los trabajos presentados en el último apartado de la Introducción de esta Tesis Doctoral, enfocados a la detección y determinación multiplexada de biomarcadores asociados al desarrollo y evolución de cualquier tipo de enfermedad neoplásica, demuestran la posibilidad de diseñar y fabricar plataformas con aplicabilidad real demostrada para la determinación sensible, selectiva y rápida de biomarcadores de diferente nivel molecular, o con rangos clínicos muy diferentes en muestras clínicas de muy variada naturaleza.