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Estos compuestos impiden el ensamblado de los MT e inducen su despolimerización, algunas veces dando lugar a la formación de anillos de tubulina (111-115). Dentro de este grupo se encuentran los derivados de Colchicina, los alcaloides de la Vinca, las Dolastatinas, las Halicondrinas y su derivado semisintético Eribulina (E7389), así como las Espongiostatinas y sus análogos. Como en el grupo anterior, la unión de estos fármacos se hace a diferentes lugares, de los cuales los más conocidos son los denominados “sitio de la Vinca” y “sitio de la Colchicina”.

La Colchicina en un producto natural obtenido como metabolito secundario de las plantas del género Colchicum (116). Aunque sus efectos citotóxicos y su afinidad por la tubulina se conocen desde hace mucho tiempo

(117, 118), actualmente sólo se emplea en el tratamiento del ataque agudo de

gota y de ciertas enfermedades inflamatorias pero no en el tratamiento del cáncer, ya que presenta una elevada toxicidad (119). En el año 2004 se publicaron las primeras coordenadas cristalográficas de la tubulina unida a Colchicina y al dominio similar a Estathmina (Stathmin Like Domain, SLD) de la proteína RB3 obtenidas mediante difracción de rayos X (120). En estos complejos la Colchicina encuentra su sitio de unión en un bolsillo hidrófobo de

la "-tubulina localizado en la interfaz de dimerización !", justo encima del

núcleotido de GTP unido al N-site. La presencia de este producto natural y de sus análogos impide los cambios conformacionales necesarios en la subunidad "

para que la tubulina adquiera la conformación recta requerida para la polimerización de los MT (121).

De los alcaloides de la Vinca de Madagascar o Vinca rosea (Catharanthus

roseus), el primero en aislarse fue la Vincoleucoblastina o Vinblastina. Su sitio

de unión, y por extensión el del resto de alcaloides de la Vinca, se describió en 2005 con la publicación de las coordenadas de la estructura del complejo Tubulina-Vinblastina-Colchicina-SLD-RB3. En el cristal el alcaloide se encuentra situado en la interfaz entre dos heterodímeros de tubulina asociados cabeza-cola, cerca del sitio hidrolizable de unión al nucleótido, por lo que el bolsillo de unión está consituido por aminoácidos tanto de la subunidad ! como de la " (122). Tres años más tardese publicaron las coordenadas obtenidas por difracción de rayos X de dos complejos de Tubulina-Colchicina-SLD-RB3 unidas a Fomopsina A y a Soblidotina, dos representantes de la familia de las Dolastatinas. Esta familia está compuesta por péptidos modificados de los que la Dolastatina 10, obtenida del molusco gasterópodo Dolabella auricularia, fue el primero que mostró inhibición de la polimerización de tubulina (123). Pese a tener una estructura química muy diferente a la de los alcaloides de la Vinca, tanto la Fomopsina A como la Soblidotina se unen a la tubulina en la interfaz entre dos heterodímeros de tubulina unidos, justo en el sitio de unión de la Vinca (124).

Por otra parte, las Halicondrinas son una familia de macrólidos de origen marino aislados de los extractos de la esponja Halichondria okadai, de los que la Halicondrina B es el más potente (125). Pese a ser moléculas extremadamente complejas, se han obtenido por síntesis química diferentes análogos simplificados, de los que la Eribulina (E7389) es el más destacado por haber sido recientemente aprobada para el tratamiento del cáncer de mama metastático (126). Estos agentes se unen a la "-tubulina cerca del sitio de unión intercambiable de GTP (127), sin afectar a la unión de Colchicina (128) pero inhibiendo la unión de alcaloides de la Vinca de forma no competitiva (129). El

resultado de su unión a la tubulina es la formación de agregados afuncionales (130).

Por último, las Espongiostatinas son macrólidos policétidos, aislados de esponjas marinas por varios grupos independientes, que han demostrado un gran poder citotóxico en un cribado realizado por el NCI con células sensibles a agentes antimitóticos (131). Pese a que su mecanismo de acción y su sitio de unión no están del todo claros, los resultados apuntan a la inhibición de la polimerización de los MT por unión a un sitio del heterodímero diferente al de los alcaloides de la Vinca (132).

De esta familia de compuestos se hará más hincapié en los alcaloides de la Vinca y en un nuevo compuesto de origen marino que está siendo desarrollado por la empresa farmacéutica española PhamaMar, puesto que han sido objeto de estudio en esta tesis.

ALCALOIDES DE LA VINCA

Pese a conocerse las propiedades de los extractos de las hojas de la Vinca

(Catharanthus roseus) desde el siglo XVII, no fue hasta finales de los años 50

que se estableció su actividad antitumoral (133). A partir de este momento comenzaron a emplearse tanto los alcaloides originales Vincristina (VNC) y Vinblastina (Vincaleucoblastina, VLB) (Figura 15) como los análogos semisintéticos Vindesina (VND), Vinorelbina (VNR) y Vinflunina (VFN) en el tratamiento de diferentes tipos de tumores, tanto sólidos como hematológicos

(39, 134).

Entre los años 80 y 90 se realizaron diversos estudios con el fin de establecer el mecanismo de acción de estas moléculas, que alteran la dinámica microtubular y la polimerización bloqueando el ciclo celular en la metafase. Si las concentraciones empleadas son subestequiométricas se provoca una estabilización de los MT, probablemente porque la unión del alcaloide al extremo unido a GTP impide la hidrólisis del nucleótido (135-137). A concentraciones más elevadas provocan la despolimerización y la formación de anillos de tubulina y estructuras paracristalinas (138, 139). Estudios termodinámicos de la unión de los alcaloides naturales de la Vinca y de algunos de sus análogos semisintéticos realizados por Correia et al. establecieron sus afinidades por la tubulina, que apenas varían en función de los isotipos de tubulina (140), y que en orden decreciente son VNC > VLB > VNR > VFN

(140, 141). Con la cristalización de un complejo de Tubulina-VLB-Colchicina-

SLD-RB3 en 2005 y su resolución hasta 4,10 Å, se localizó el sitio de unión de VLB en la intefaz entre dos heterodímeros de tubulina, en un lugar próximo al bolsillo de unión de la base nitrogenada del núcleotido en el sitio hidrolizable (Figura 16).

Figura 16: detalle de la unión de la VLB a la interfaz "1-!2 entre dos heterodímeros de tubulina en el cristal depositado en el PDB bajo el código 1Z2B. La !-tubulina está coloreada en verde, la "-tubulina en cian, las moléculas de núcleotido en magenta, las moléculas de Colchicina en blanco, la VLB en amarillo y el SLD RB3 en rosa.

La Vinblastina introduce una cuña en esta interfaz que no sólo impide la correcta interacción longitudinal de los dos heterodímeros sino que inhibe la hidrólisis del GTP al mantener alejado del fosfato gamma el Glu254 presente en la subunidad ! (122). Recientemente se ha determinado que los alcaloides de la vinca y otros ligandos interfaciales reconocen la tubulina curvada unida a Estathmina (55).

“To err is human, but to really foul things up you need a

computer”

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MÉTODOS

2.1 Bases Teóricas del Modelado Molecular

Para el estudio de los sistemas biológicos mediante modelado molecular se tienen que emplear una serie de herramientas computacionales, como potentes computadoras y programas de gráficos moleculares, en conjunción con un buen número de reglas y procedimientos teóricos. Gracias a la rápida evolución de la potencia de los ordenadores, se han podido desarrollar técnicas computacionales cada vez más complejas que nos permiten definir y estudiar los sistemas biológicos a diferentes niveles de teoría. Sin embargo, pese a la potencia de los ordenadores actuales, el estudio de los sistemas de gran tamaño depende de limitaciones tanto de tiempo como de recursos materiales. De esta forma, es necesario emplear aproximaciones para mantener la viabilidad del experimento aplicando distintos niveles de teoría en función del tamaño del sistema que va a ser analizado ya que, a medida que aumenta el nivel teórico aumenta la calidad de los resultados pero también se incrementa notablemente el coste computacional. En este sentido se pueden emplear tres tipos de métodos: cuánticos, clásicos e híbridos, en función de la finalidad del estudio que se quiera realizar.

Los métodos cuánticos tienen en cuenta los núcleos y los electrones en el cálculo, haciendo posible el estudio de la estructura y de las propiedades que dependen de la distribución electrónica, así como el estudio de la reactividad química (formación y ruptura de enlaces). Sin embargo, su aplicabilidad está

restringida a sistemas con centenares de átomos como máximo, siendo inviable para aquellos constituidos por miles de átomos en ausencia de recursos de supercomputación. Los métodos clásicos emplean la aproximación de Born- Oppenheimer en la que, debido a su masa insignificante comparada con la del núcleo, se ignoran los movimientos propios de los electrones y se considera que se ajustan al movimiento de los núcleos atómicos, por lo que la energía de una molécula o conjunto de moléculas se calcula únicamente en función de la disposición de los núcleos atómicos. Este nivel de teoría es el que se escoge generalmente para estudiar macromoléculas biológicas. Los métodos híbridos se han desarrollado recientemente para estudiar procesos químicos que requieren de altos niveles de teoría, como reacciones químicas, dentro del seno de sistemas complejos, como proteínas en el caso de las reacciones enzimáticas. Para ello estos métodos son capaces de describir una pequeña parte del sistema mediante métodos cuánticos y el resto mediante métodos clásicos (1).

2.1.1 Métodos Cuánticos (QM)

Estos métodos emplean la mecánica cuántica (Quantum Mechanics, QM) y pueden dividirse en dos grupos: los métodos ab initio y los métodos semiempíricos. El término ab initio significa “desde el principio” o “a partir de primeros principios”, y hace referencia a que estos métodos requieren únicamente de las constantes físicas, por lo que no necesitan parámetros ajustados aunque pueden llegar a ser extremadamente costosos desde el punto de vista computacional. Por el contrario, los métodos semiempíricos son aproximados e incorporan parámetros derivados de datos experimentales, por lo que pueden calcular propiedades del sistema de una forma relativamente precisa con un gasto computacional mucho menor.

Debido a estas diferentes características, estos dos métodos se emplean con fines diferentes en función del problema a resolver. Los métodos ab initio son capaces de proporcionar información sobre la distribución de la carga del núcleo y

de la corteza electrónica, por lo que se emplean para calcular el potencial electrostático molecular (Molecular Electrostatic Potential, MEP) de los ligandos (Figura 17).

Figura 17: representación del MEP positivo (cian) y MEP negativo (magenta) del Paclitaxel (centro). Al mostrar los potenciales por separado (izquierda y derecha) se aprecia mejor la distribución del potencial en la molécula y se puede intuir el potencial complementario que será necesario en el sitio receptor.

A partir del MEP o del potencial electrostático de superficie (Electrostatic

Surface Potencial, ESP), estos métodos son capaces de obtener las cargas

parciales de cada átomo. Estas cargas atómicas se emplean posteriormente en los métodos clásicos para derivar las interacciones electrostáticas mediante un potencial generalmente coulómbico. Por esta razón, la calidad de las cargas obtenidas ab initio es crítica para los métodos clásicos. De hecho, el proceso de obtención de cargas atómicas se refinó en el campo de fuerzas de AMBER

(Assisted Model Building with Energy Refinment) (142) dando lugar a un ajuste

mediante restricción del potencial electrostático a la superficie molecular

(Restrained Electrostatic Surface Potential, RESP) (143-145), obteniéndose de

esta forma una distribución de la carga más uniforme.