Summary and Conclusions - Internet Banking: Developments and Prospects

La búsqueda de las estatinas presentes en especies del género Pleurotus, ha sido un interesante tema de investigación abordado dentro del grupo de Química de Hongos Macromicetos, en pro de lograr las condiciones óptimas tanto de cultivo que permitan su producción por procesos fermentativos, como la posterior extracción, detección y en caso de que estas estén presentes, su purificación y elucidación estructural. Con este objetivo, se planteó en primer lugar la búsqueda de una forma de detectar dichos metabolitos en los extractos. La técnica hasta ahora empleada de CG-EM en modo SCAN tiene la desventaja de la elusión a tR cercanos de los compuestos triterpenoidales y de las

formas lactónicas de las estatinas, como se observa en la Figura 4-2. Esta similitud en el comportamiento cromatográfico de los dos grupos de metabolitos, dificulta la detección y posterior determinación de los compuestos de interés que pudiesen estar presentes en los extractos.

Figura 4-2: CG-EM de mezclas de compuestos triterpenoidales y estatinas.

A) una mezcla de lanosterol (LAN), dihidrolanosterol (DLAN), lovastatina en forma lactónica (LOVL) y simvastatina en forma lactónica (SIML) B) Extracto de Pleurotus djamor cultivado con salvado de trigo como FC.

Es importante mencionar que al emplear esta técnica, en los cromatogramas de gases tanto para los

patrones de LOVL como de SIML, se observan dos picos par cada uno de ellos: con tR = 34,379 min

(LOVL2) y 34,969 min (SIML2) los generados por la pérdida de los ácidos 2-metilbutanoico y 2,2- dimetilbutanoico respectivamente; con tR = 32,193 min (LOVL1) y 32,647 min (SIML1) se

encuentran los generados por la posterior deshidratación de la β-OH lactona (Figura 4-15). Estas fragmentaciones han sido reportadas por otros autores como las características para la Lovastatina y la simvastatina (280), sin embargo no existe información en literatura sobre la aparición de los dos picos en CG, pero ésta puede deberse a rompimientos que sufren en el momento de la inyección por las condiciones del análisis, debidas a la labilidad de los enlaces involucrados en las pérdidas que generan los fragmentos detectados.

Estas observaciones condujeron la necesidad de plantear una metodología más apropiada para poder evaluar la presencia de estatinas en los productos biotecnológicos obtenidos de los Pleurotus a partir de la FEL, empleando las harinas como FC. Con este objetivo se desarrolló la metodología descrita

DLAN LOVL2 SIML2 LOVL1 SIML1 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 0 100000 200000 300000 400000 500000 600000 700000 800000 900000 1000000 1100000 1200000 1300000 Time--> Abundance TIC:10082603.D LAN 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 110000 120000 130000 140000 150000 160000 170000 180000 190000 200000 Time--> Abundance TIC:10081002.D B) A)

en el capítulo 3 que será aplicada, en esta parte de la investigación, a los extractos en AcOEt de los productos biotecnológicos de interés.

En el procedimiento de extracción descrito en el numeral 2.2.2 y esquematizado en la figura 2-3, se planteó la realización de un proceso de hidrólisis, con el objetivo de hacer una extracción selectiva de las estatinas, aprovechando sus características estructurales que les permiten formar los hidroxiácidos de las formas lactónicas. Este procedimiento se hizo con el P. ostreatus, pero como se describió en la discusión del capítulo 2, los perfiles de CG-EM no evidenciaron diferencias significativas y por ende no se efectuó este procedimiento para las especies de P. pulmonarius y P.

djamor.

Con respecto a los diferentes productos obtenidos, la figura 4-3 muestra los perfiles cromatográficos en CLAE de los extractos en AcOEt para los medios agotados del P. ostreatus cultivado con las doce fuentes de carbono. En ninguno de los casos se observaron picos con tR coincidentes con los de los

patrones empleados. Se detectaron entre 2,8 min y 4,4 min picos con intensidades variables en los caldos agotados obtenidos empleando todas las FC a excepción del uso de las harinas de cebada y de maíz. Para el caso del maíz amarillo se detectó un pico a 10,3 min.

Figura 4-3: Perfiles de CLAE de los extractos en AcOEt de los medios agotados de Pleurotus ostreatus obtenidos por FEL con las diferentes FC.

CB harina de cebada; AV harina de avena; TR harina de trigo; AZ harina de arroz; BT bienestarina; MZ harina de maíz; SY harina de soya; ST salvado de trigo; TI harina de trigo integral; MP harina de maíz pinto; SG harina de siete granos; MA harina de maíz amarillo.

Tiempos de retención de los patrones: Pravastatina 5,25 min; Hidroxiácido lovastatina 12,7 min; Hidroxiácido simvastatina 13,6 min; Lovastatina en forma lactónica 14,3 min; Simvastatina en forma lactónica 15,1 min.

Para el caso de los extractos de los micelios, de igual forma independientemente de la FC utilizada, no se observó un pico coincidente con los tR de los patrones (Figura 4-4). Sin embargo, se evidenció

la presencia de un pico con tR de 14,1 min, intermedio con respecto al de los estándares de SIMH y

LOVL, que varía en intensidad entre las FC empleadas. Adicional a esto se observa la presencia de un pico a 14,4 min con menor intensidad que el anterior, pero de igual forma detectado en los micelios obtenidos con todas las harinas. Para el caso del uso de CB, AV, TR, BT, MZ y TI, se

SG MA AV TR AZ BT MZ SY TI MP

detectó un pico a 13,7 min con bajas intensidades, así como uno a 17,2 min para TR, BT, MZ, SY y TI.

Figura 4-4: Perfiles de CLAE de los extractos en AcOEt de los micelios de Pleurotus ostreatus obtenidos por FEL con las diferentes FC.

CB AV TR AZ BT MZ SY ST TI MP SG MA

En los extractos en AcOEt de los productos de la hidrólisis básica de los micelios, se esperaría que las formas lactónicas de las estatinas que estuviesen presentes se hidrolizaran formando sus correspondientes sales insolubles en el disolvente extractante, por ende en estos extractos no se detectarían los metabolitos de interés. Sin embargo, salvo el producto obtenido empleando harina de cebada, en todos los extractos se detectó el pico a 14,1 min. En relación al pico en 14.4 min exceptuando CB, BT, MZ, SY y SG, con las restantes FC su detección de igual forma fue positiva (Figura 4-5), pero con intensidades en los extractos menores al compararlas con las de los micelios. Este comportamiento lleva a plantear dos hipótesis:

a) Las condiciones de hidrólisis de las formas lactónicas de las estatinas determinadas en el capítulo 3 como óptimas, no son aplicables para los extractos, teniendo en cuenta la complejidad de los mismos y la presencia de otro grupo de compuestos, que podrían estar reaccionando con la base y por ende el proceso de hidrólisis de las estatinas no es completo;

b) Los picos detectados en CLAE -UV no corresponden a estatinas. Esta segunda hipótesis se discutirá posteriormente.

Sumado a esto, se detectaron picos con tR de 9,5 min y 10,3 min en los productos obtenidos

empleando todas las harinas, salvo con CB, AV y ST.

Figura 4-5: Perfiles de CLAE de los extractos en AcOEt del producto de la hidrólisis a pH básico de Pleurotus ostreatus obtenidos por FEL con las diferentes FC.

CB harina de cebada; AV harina de avena; TR harina de trigo; AZ harina de arroz; BT bienestarina; MZ harina de maíz; SY harina de soya; ST salvado de

trigo; TI harina de trigo integral; MP harina de maíz pinto; SG harina de siete granos; MA harina de maíz amarillo. Tiempos de retención para los patrones:

Pravastatina 5,25 min; Hidroxiácido lovastatina 12,7 min; Hidroxiácido simvastatina 13,6 min; Lovastatina en forma lactónica 14,3 min; Simvastatina en forma lactónica 15,1 min

La neutralización de los productos de la hidrolisis básica de los micelios, permite generar las formas hidroxiácidas de las estatinas que estuviesen presentes, y que por reportes de literatura y por sus características estructurales, se sabe son solubles en el disolvente extractante (281). Como se

AV TR AZ BT MZ SY TI MP MA SG

observa en la figura 4-6 los perfiles cromatográficos para los extractos provenientes de la neutralización del producto de la hidrólisis de los micelios del P. ostreatus, son similares a los de los extractos de los micelios sin tratamiento (Figura 4-4), con una marcada diferencia entre ellos en las intensidades de los picos detectados, demostrando que no hay diferencias entre los extractos en AcOEt de los micelios sin hidrolizar y los productos de la hidrolisis neutralizados, resultado que llevó a eliminar el paso de la hidrólisis para los micelios de las especies P. pulmonarius y P. djamor.

Figura 4-6: Perfiles de CLAE de los extractos en AcOEt del producto de la hidrólisis a pH neutro de Pleurotus ostreatus obtenidos por FEL con las diferentes FC.

AZ BT MZ SY ST MP SG MA CB AV TR

En las figuras 4-7 y 4-8 se encuentran los perfiles de CLAE para los extractos de los medios agotados de las especies de P. pulmonarius y P. djamor respectivamente. El comportamiento es similar al observado para el P. ostreatus con la detección de varios picos entre 2,8 min y 4,4 min. Sin embargo sobresalen por su intensidad, para las dos especies al ser cultivadas empleando soya y salvado de trigo un pico con un tR de 4,1 min y para el P. pulmonarius cultivado con harina de arroz un pico

con tR de 3,1 min.

Figura 4-7: Perfiles de CLAE de los extractos en AcOEt de los medios agotados de Pleurotus pulmonarius obtenidos por FEL con las diferentes FC.

CB AV TR AZ BT MZ TI

Tiempos de retención para los patrones: Pravastatina 5,25 min; Hidroxiácido lovastatina 12,7 min; Hidroxiácido simvastatina 13,6 min; Lovastatina en forma lactónica 14,3 min; Simvastatina en forma lactónica 15,1 min.

Figura 4-8: Perfiles de CLAE de los extractos en AcOEt de los medios agotados de Pleurotus djamor obtenidos por FEL con las diferentes FC.

SY ST TI MP SG MA CB AV TR AZ BT MZ

Para el caso de los micelios de P. pulmonarius (Figura 4-9) y P. djamor (Figura 4-10), al igual que con los de P. ostreatus, no se detectó ningún pico que coincidiera con los tR de los patrones. De

nuevo se evidenció la presencia de los correspondientes a 14,1 min y 14,4 min, pero en este caso con mayores intensidades, no obstante para las tres especies cultivadas con TI, la altura de los picos detectados es la mayor comparada con las obtenidas con las FC restantes.

Figura 4-9: Perfiles de CLAE de los extractos en AcOEt de los micelios de Pleurotus pulmonarius obtenidos por FEL con las diferentes FC. SY ST TI MP SG MA CB AV TR AZ BT MZ

Figura 4-10: Perfiles de CLAE de los extractos en AcOEt de los micelios de Pleurotus djamor obtenidos por FEL con las diferentes FC. SY ST TI MP SG MA CB AV TR AZ BT MZ SY ST TI

Los resultados hasta ahora descritos se pueden resumir de la siguiente forma:

a) En los extractos de los medios agotados no hubo detección de picos que coincidieran con los tR de los patrones, independientemente de la FC o de la especie estudiada. Esta

observación pone de manifiesto que aparentemente no hay excreción de las formas hidroxiácidas de las estatinas hacia el medio o que estas se encuentran en cantidades por debajo del LD de la técnica empleada, resultado contrastante con lo encontrado para

Pleurotus por otros autores quienes reportan la presencia de estatinas en los caldos de

cultivo (189, 191, 262).

b) En los extractos de los micelios de las tres especies, con las doce harinas de cereales, se detectaron picos con intensidades altas pero que eluyen a tR diferentes a los de los

estándares, cuyos valores son intermedios a los correspondientes para las formas hidroxiácidas de la simvastatina y la lactónica de la lovastatina (14,1 min) y entre esta última y la forma lactónica de la simvastatina (14,4 min).

Estas observaciones llevan a plantear diferentes hipótesis a saber:

a) Los picos detectados corresponden a componentes de los extractos diferentes de las estatinas empleadas como estándar o a derivados estructurales de ellas y/o intermediarios biosintéticos de las mismas;

b) La metodología desarrollada no es adecuada para la detección de estatinas en este tipo de productos;

c) Las FC empleadas no son el sustrato apropiado para la biosíntesis de las estatinas; d) En el estadío de desarrollo micelial no hay producción de estatinas, específicamente para estas cepas;

e) Las cepas de trabajo no producen los bioactivos de interés. MP

Con el objetivo de confirmar o descartar cada una de estas suposiciones, se realizaron una serie de procedimientos experimentales que se discutirán a continuación:

4.3.2. Aproximación a la identidad de los componentes identificados por CLAE-UV en los

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