El fenómeno de senescencia celular está activado por diferentes estímulos y no sólo implica la detención de la división celular sino que va acompañado de otros fenómenos provocando cambios fenotípicos utilizados como marcadores de senescencia para su posterior identificación tanto in vitro como in vivo(Figura 12).
Figura 12. Alteraciones morfológicas de las células senescentes (45).
- Incremento del contenido lisosomal. Un biomarcador ampliamente utilizado para
detectar senescencia en células es la actividad de la enzima β-galactosidasa asociada
a senescencia (del inglés Senescence associated β-Galactosidase, SA-β-Gal). Kurt et
al. (90) observaron en cultivos celulares sometidos a más pases celulares y por tanto
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galactosidasa lisosomal debido a un aumento del número y contenido de lisosomas permitiendo su detección a pH=6.
Para explicar el origen lisosomal de la enzima β-galactosidasa que da nombre a un
tipo de senescencia, evidencias genéticas proporcionaron información sobre el gen
GLB1, el cual codifica a esta enzima. Células senescentes obtenidas de senescencia
replicativa o inducida presentaban una acumulación de GLB1 tanto a nivel de ARNm
como proteico (91).
La proteína que sustenta la actividad de SA-β-gal es la β-D-galactosidasa detectada en condiciones normales a pH=4. Cuando las células se vuelven senescentes y se incrementa la biogénesis lisosomal elevando el pH a 6 se alcanza un índice de alcalinidad adecuado para cuantificar el incremento de la actividad β- galactosidasa. El primer método de detección fue citoquímico y usó el sustrato
cromogénico 5-bromo-4-chloro-3-indoyl β-D-galactopyranoside (X-gal) que se anclaba
a la enzima. El segundo método incluyó en un primer paso el empleo de inhibidores lisosomales como Cloroquina o Bafilomicina A1 para verificar el origen lisosomal de la
SA-β-gal concentrando en un ambiente básico estos orgánulos. El sustrato
fluorescente utilizado fue 5-dodecanoylaminofluoerecein di-β-D-galactopyranoside
(C12FDG) que también presentaba la capacidad de unirse a la enzima (92).
Aunque SA-β-gal es un marcador ampliamente utilizado en estudios de
senescencia celular no es específico de este fenómeno, por lo que la validación de este proceso se debe confirmar evaluando los niveles de otros marcadores.
- Forma y tamaño celular. Las células senescentes in vitro presentan cambios en su morfología llegando a ser más largas, aplanadas, engrosadas o multinucleadas. Su fenotipo depende del tipo de estímulos que inducen senescencia (93). Un contribuidor a la alteración de la forma celular asociada a la senescencia es la pérdida de integridad estructural del citoesqueleto, principalmente por los cambios en los filamentos de actina (94, 95). Asimismo, el crecimiento y el tamaño celular están regulados por varias cascadas de señalización siendo la mejor caracterizada la activación de la vía IGF/PI3K/AKT/mTOR. El mediador principal es mTORC1 que promueve múltiples procesos biológicos como la captación de nutrientes, la biosíntesis de lípidos y modula el metabolismo celular para promover la biogénesis. Está implicado en el proceso de autofagia actuando como un inhibidor de esta vía y actúa negativamente sobre la vía del receptor IGF para controlar la homeostasis del tamaño celular (45, 96).
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- Cambios en la arquitectura nuclear. La organización dentro de los núcleos es importante para mantener una estabilidad celular ya que los defectos en la lamina nuclear pueden causar inestabilidad genómica. La deformación de la arquitectura nuclear podría ser una importante causa de senescencia celular. Mutaciones en los genes que codifican las proteínas de esta envoltura causan laminopatías que derivan en enfermedades de envejecimiento prematuro como el Síndrome de Hutchinson- Gilford (HGPS) (43).
El mecanismo molecular responsable del HGPS está activo en las células sanas que al sufrir un proceso de envejecimiento fisiológico adquieren defectos similares a los que tienen las células que sufren una inestabilidad genómica de la envoltura nuclear como modificaciones en las histonas e incremento del ADN dañado que resulta en un incremento de la sensibilidad de especies reactivas de oxígeno conduciendo a daño oxidativo (94, 97).
- Composición de la membrana plasmática. Durante la senescencia celular las células experimentan cambios en la composición proteica de la membrana plasmática lo que permite incorporar una nueva estrategia para identificar marcadores asociados con el proceso de senescencia.
La proteína de la membrana plasmática más estudiada en este tipo de alteración morfológica es la Caveolin-1. Su expresión se encuentra aumentada en las células senescentes, participa en la vía de la quinasa p38MAPK (98, 99) e incrementa la actividad de p53 a través de la ATM, los cuales son efectores positivos de múltiples estímulos en el proceso de senescencia (100, 101). En cambio, una deficiencia de esta proteína está relacionada con la senescencia prematura vía disfunción mitocondrial e inactivación de SIRT-1 (102).
Otras proteínas pertenecientes a la membrana plasmática y que experimentan cambios en las células senescentes son DEP1, B2MG y la forma oxidada de vimentina (45).
- Acumulación de mitocondria. Las células senescentes presentan un incremento del número de mitocondrias disfuncionales debido a que el proceso de reciclaje propio de estas organelas conocido con el nombre de mitofagia está alterado lo que contribuye a un tipo de senescencia asociada con la disfunción mitocondrial (del inglés Senescence-associated mitochondrial dysfunction, SAMD) (103).
La disfunción mitocondrial es un marcador del envejecimiento (43) y está ligada a la senescencia celular a través de la fosforilación de ATM y de la vía Akt/mTORC1. Se conocen por ser efectores que integran señales de la DDR promoviendo la activación
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transcripcional del regulador de la biogénesis mitocondrial PGC-1β, contribuyen a la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y participan en la detención del ciclo celular. La producción de ROS mantiene la activación de las DDR lo que
estabiliza la senescencia celular y el fenotipo pro-oxidante e inflamatorio (Figura 13)
(104, 105). La degradación de las mitocondrias dañadas está mediada por PTEN-
induced putative protein kinase 1 (PINK1) y por la E3 ubiquitin-protein ligase Parkin. En las patologías relacionadas con el envejecimiento existe una pérdida de los genes Pink1 y Parkin por lo que son los marcadores empleados para estudiar el proceso de mitofagia característico de la senescencia asociada a la disfunción mitocondrial.
Figura 13. Representación de la participación de la mitocondria en el proceso de senescencia (104)