Test 1: Preliminary Testing

5.2.1. Métodos de extracción selectiva de la fracción orgánica de mercurio

Debido al singular riesgo que supone la presencia de MeHg en el medio ambiente, han sido y siguen siendo muy numerosos los métodos analíticos que se han desarrollado para su determinación cuantitativa en todo tipo de muestras. Como rasgo común a todos ellos, está la necesidad de separar los compuestos orgánicos de mercurio del resto de la muestra sin romper los enlaces C-Hg originales. La conservación de estos enlaces inalterados es esencial para poder conseguir el aislamiento conjunto de los compuestos organomercúricos empleando agentes apropiados, así como para poder separar y cuantificar posteriormente estos compuestos al aplicar un método cromatográfico.

Para liberar los compuestos organomercúricos de muestras sólidas, suelos y sedimentos principalmente, la gran mayoría de los métodos desarrollados en la bibliografía se basan en una etapa de extracción previa, en la cual la muestra original se pone en contacto con una disolución de un agente extractante, que teóricamente es capaz de liberar las especies organomercúricas sin alterar el enlace C-Hg original. Tras esta etapa, la disolución puede ser sometida a tratamientos posteriores, tales como preconcentración, reextracción, etc, con vistas a separar, aislar y cuantificar de forma apropiada las especies de interés.

Capítulo 5: DESARROLLO DE UN MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE Hg ORGÁNICO

Uno de los métodos más relevantes desarrollado para la determinación de MeHg en suelos y sedimentos fue el de Westöö [19], basado en una digestión ácida suave con HCl combinada con una extracción con benceno, seguida de una etapa posterior de reextracción para reducir el número de interferencias. Para este propósito se eligió la cisteina como agente reextractante debido a la gran afinidad del grupo –SH por los compuestos de mercurio. Finalmente, el mercurio asociado a la cisteina se extrae de la disolución acuosa con benceno y se analiza mediante cromatografía de gases. La mayoría de los métodos de extracción de MeHg basados en una extracción ácida derivan del método Westöö original, con algunas modificaciones, tales como el uso de NaCl [20, 21], KBr [22-24], ácido iodoacético [25], HgCl2 [19, 26] o CuCl2 [27] en el

medio ácido para facilitar la liberación de los cationes CH3Hg+ presentes en el sólido y

que probablemente se pueden encontrar asociados a grupos sulfidrilo dentro del sólido.

Alternativamente a la extracción ácida, algunos autores han desarrollado procedimientos de extracción de especies orgánicas de mercurio empleando disoluciones alcalinas como KOH-metanol [28-30] o NaOH-cisteina [31]. Estos procedimientos son capaces de extraer el MeHg de los sedimentos sin romper los enlaces originales C-Hg y suelen proporcionar buenos resultados en la recuperación de MeHg de las muestras. Sin embargo, en comparación con los métodos de extracción ácida presentan algunas desventajas, tales como la dificultad de obtener disoluciones alcalinas de elevada pureza o que el manejo de este tipo de extractos suele hacer más complicadas las etapas de preconcentración, separación y detección. Además, en algunas muestras, pueden surgir problemas debido al elevado porcentaje de materia orgánica e ión férrico coextraídos con el MeHg [27].

La etapa de digestión, bien sea ácida o alcalina, no permite la separación de las especies organomercúricas del resto de especies de mercurio presentes en las muestras. Para separar estas especies se han desarrollado diferentes procedimientos, la mayoría de los cuales están basados en una extracción empleando un disolvente orgánico con el fin de separar las especies orgánicas de mercurio del mercurio inorgánico mayoritario. Como disolventes orgánicos, los más utilizados han sido el tolueno [32, 33], cloroformo [22, 34] y diclorometano [28, 35]. Todos ellos son selectivos a la hora de extraer el MeHg y el resto especies orgamercúricas que puedan estar presentes en la muestra (etilmercurio,

fenilmercurio, etc). Entre ellos, el diclorometano presenta una serie de ventajas dada su volatilidad intermedia entre el cloroformo, excesivamente volátil, lo que hace difícil su manejo y dificulta la toma de volúmenes precisos, y el tolueno bastante menos volátil y más difícil de eliminar en una etapa posterior de reextracción. Otros esquemas de extracción ensayados por diferentes autores, tratan de evitar el empleo de disolventes orgánicos, mediante una destilación del extracto procedente de la digestión ácida [27], o bien mediante la propia volatilización del MeHg en una corriente de vapor de aire o nitrógeno [25, 27]. Estos procedimientos eliminan las interferencias negativas de matriz pero presentan otros problemas asociados como la formación de artefactos de MeHg durante la destilación. Incluso otras alternativas se basan en procesos de extracción en fase sólida posterior a la digestión ácida para separar, aislar y preconcentrar las especies orgánicas de mercurio [36, 37]. En estos, cabe destacar el empleo de fibra de algodón de sulfidrilo como medio adsorbente de especies organomercúricas que posteriormente pueden ser eluidas selectivamente mediante el paso por la columna de un agente eluyente apropiado [37].

En el caso de utilizar disolventes orgánicos para la extracción, las especies organomercúricas, una vez aisladas en ellos, pueden ser reextraídas a una fase acuosa para su posterior análisis o conservación. De esta forma, además, se suele conseguir una preconcentración de los analitos, necesaria en la mayoría de los casos debido al bajo nivel de concentración de mercurio orgánico habitualmente presente en las muestras de suelos y sedimentos. En esta etapa, el disolvente orgánico puede eliminarse, generalmente, mediante su evaporación, especialmente si se trata de cloroformo o diclorometano, y ésta a su vez puede lograrse por mero calentamiento o por arrastre con un gas inerte, que suele ser nitrógeno [27, 38, 39]. Algunos autores emplean en la reextracción simplemente agua en contacto con una alícuota de la fase orgánica y evaporan esta última [38, 39]. Otros emplean en su disolución acuosa agentes reextractantes, que por lo general suelen estar basados en el grupo sulfidrilo. Los más utilizados son el tiosulfato sódico y la cisteina [24, 40-42]. Un derivado de este último, la N-acetil-L-cisteina, tiene además un efecto estabilizador previniendo de forma efectiva pérdidas de alquilmercurio de las disoluciones aunque el mecanismo por el cual este reactivo inhibe las transformaciones de las especies orgánicas de mercurio aún no está claramente establecido [7].

Capítulo 5: DESARROLLO DE UN MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE Hg ORGÁNICO

Así pues, este esquema de digestión suave, extracción con disolventes orgánicos, seguida de reextracción es el más habitual en los métodos de determinación de MeHg en muestras de suelos y sedimentos.

Uno de los problemas asociados a la aplicación de métodos de extracción y determinación de MeHg en suelos y sedimentos es la posible formación de artefactos de MeHg, esto es, MeHg generado artificialmente durante la aplicación del método analítico [38, 43]. La formación de los artefactos se relaciona con la materia orgánica presente en la muestra y con la presencia de especies que puedan donar grupos metilo, tales como acetatos. El grado de metilación aumenta significativamente con la temperatura, mientras que la influencia del pH varía en función del tipo de material orgánico presente, de forma que, bajo condiciones ácidas, los ácidos fúlvicos, más ligeros y solubles, favorecerán la metilación y, en condiciones neutras y básicas, será la materia húmica la que ejerza un mayor efecto metilante del mercurio inorgánico [5]. Éste es un problema común a todos los métodos de extracción de MeHg, si bien se ha demostrado que afecta de forma más importante a aquellos que incluyen una etapa de destilación acuosa [38, 44]. Se puede establecer un orden de porcentaje de artefacto formado, respecto al mercurio total de la muestra se puede según los diversos métodos de extracción de la forma: Destilación > Digestión alcalina > Digestión ácida. De los métodos consultados en la bibliografía el que presenta un menor porcentaje de formación de artefacto de MeHg es el método de Bloom et al. [38]. Éste es un método basado en una digestión ácida suave de la muestra sólida en una disolución KBr/CuSO4

en H2SO4, seguida de una extracción con diclorometano y reextracción en fase acuosa.

De esta forma, se consigue aislar y extraer de forma cuantitativa las especies orgánicas de mercurio sin alterar los enlaces C-Hg y con un grado de metilación del mercurio inorgánico que se estima en torno al 2,5⋅10-3

%.

5.2.2. Técnicas analíticas empleadas en la determinación de especies orgánicas de Hg.

Al igual que ocurre con los métodos de extracción, las técnicas propuestas por los diferentes autores para la determinación del MeHg y otras especies orgánicas de mercurio extraídas, son numerosas y variadas. Las más utilizadas en la separación y

cuantificación de estas especies son las técnicas cromatográficas, especialmente la Cromatografía Gaseosa acoplada a diferentes sistemas de detección, siendo los más comunes el de Detección de Captura Electrónica (GC-ECD) [23, 45], la Espectrometría de Emisión Atómica con fuente de Plasma inducido por Microondas (GC-MIP-AES) [2, 25, 34, 46], la Espectrometría de Masas con Fuente de Plasma Acoplado por Inducción (GC-ICP-MS) [47, 48] y, más recientemente, la Espectrometría de Fluorescencia Atómica con Generación de Vapor Frío (GC-CV-AFS) [24, 27]. También se ha utilizado con frecuencia la Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) acoplada a diferentes sistemas de detección más o menos sensibles como la Espectrometría UV- visible (HPLC-UV) [49, 50], la Espectrometría de Masas con Fuente de Plasma Acoplado por Inducción (HPLC-ICP-MS) [51, 52], la Espectrometría de Absorción Atómica con Generación de Vapor Frío (HPLC-CV-AAS) [53, 54] o la Espectrometría de Fluorescencia Atómica con Generación de Vapor Frío (HPLC-CV-AFS) [55, 56]. Estos métodos cromatográficos permiten la especiación de los compuestos organomercúricos y ofrecen límites de detección bajos. El problema que presentan es la complicada instrumentación requerida y la necesidad de acoplamiento de las diferentes técnicas que, a veces, puede resultar demasiado dificultosa, como por ejemplo al tratar de hacer compatible el caudal a través de la columna de HPLC con el caudal utilizado en la nebulización de las muestras en un detector de plasma.