The Autoregressive Conditional Duration (ACD) Model

El diagnóstico del episodio trombótico en los miembros inferiores y/ó embolismo pulmonar, también denominado VTE, fue realizado mediante probabilidad clínica, niveles de dímero D, ultrasonografía o venografía, screening pulmonar por ventilación-perfusión y, cuando fue necesario, por flebografía o angiografía pulmonar.

El estudio de trombofilia se realiza en pacientes que han sufrido un evento trombótico a una edad inferior a los 50 años, o presentan trombosis recurrente, o tienen una historia de trombosis familiar positiva, o la trombosis tiene una localización inusual, o bien se trata de una trombosis considerada como idiopática (desarrollada en ausencia de cualquier factor de riesgo precipitante: uso de anticonceptivos orales, cirugía, embarazo o puerperio, traumatismo o inmovilización).

Excluimos del estudio todos aquellos individuos que estaban en tratamiento con anticoagulantes orales y aquellos pacientes que presentaban alguna de las siguientes patologías: cáncer, síndrome nefrótico, disfunción renal o hepática, enfermedades inflamatorias o infecciosas, fallo cardiaco o lupus anticoagulante. También se excluyeron aquellas mujeres en tratamiento con anticonceptivos orales o terapia hormonal sustitutiva.

3.1.1.1. ESTUDIO DE LA CONTRIBUCIÓN DE LOS POLIMORFISMOS IDENTIFICADOS EN EL GEN DEL EPCR SOBRE EL RIESGO DE VTE, EN SUJETOS PORTADORES DE LA MUTACIÓN 20210A DEL GEN DE LA PROTROMBINA

En los registros del Hospital Universitario La Fe de Valencia identificamos 125 pacientes caucásicos que habían sufrido, al menos, un VTE, portadores de la mutación 20210A en el gen de la protrombina (PT), no relacionados entre sí y que fueron referidos al hospital para un estudio de trombofilia entre 1996 y 2006.

De los 125 pacientes identificados como portadores de la mutación 20210A del gen de la PT, 7 fallecieron antes del estudio, 13 no pudieron ser localizados, 12 no aceptaron participar en el estudio y en 9 el estudio familiar no fue posible. Por lo tanto, 84 propósitos participaron finalmente en el estudio (47 mujeres y 37 hombres). La edad media del primer evento trombótico fue 40 años (mujeres 37 años; hombres 44 años).

En total, los 84 propósitos tenían 405 familiares de primer grado todavía vivos, de los cuales 302 dieron su consentimiento informado y participaron en el estudio. Los familiares menores de 16 años fueron excluidos del estudio. Un total de 162 familiares fueron identificados como portadores de la mutación en el gen de la protrombina (93 mujeres y 69 hombres), entre los cuales 13 habían experimentado un evento trombótico (6 mujeres y 7 hombres). De los 140 familiares restantes sin la mutación (64 mujeres con una edad media de 42 años y 76 hombres con una edad media de 44 años), 2 habían sufrido un evento trombótico (uno afecto de una deficiencia de PC y el otro portador de la mutación FV Leiden).

De todos ellos se obtuvo una muestra de sangre para el estudio genético, y otra de sangre anticoagulada con citrato, para la obtención de plasma con el cual realizar las determinaciones de diversos parámetros plasmáticos.

3.1.1.2. ESTUDIO DE LA ASOCIACIÓN DEL POLIMORFISMO C1418T DEL GEN DE LA TROMBOMODULINA, LOS NIVELES PLASMÁTICOS DE TROMBOMODULINA SOLUBLE Y LOS DE PROTEÍNA C ACTIVADA CON EL RIESGO DE TROMBOEMBOLISMO VENOSO

Los sujetos que participaron en este estudio procedían de 3 hospitales Españoles: Hospital Universitario La Fe de Valencia, Hospital General Universitario J.M. Morales Meseguer de Murcia y Hospital Clínico Universitario de Salamanca.

El grupo de pacientes estaba formado por 1.173 individuos (613 hombres y 560 mujeres) caucásicos que habían sufrido, al menos, un episodio de VTE. La edad media era de 46 años (hombres 48 años y mujeres 44 años).

El grupo control estaba formado por 1.311 individuos (705 hombres y 606 mujeres) voluntarios no relacionados entre sí, con una distribución de edad y sexo similar al grupo de pacientes (edad media 44 años; hombres 46 años y mujeres 44 años), y de la misma región geográfica que éstos. Todos ellos estaban aparentemente sanos y ninguno presentaba historia personal o familiar de trombosis. Este grupo fue reclutado paralelamente a la inclusión de pacientes, entre el personal sanitario de los tres hospitales mencionados, familiares o amigos de éstos, o entre individuos que iban a someterse a pruebas pre-operatorias para intervenciones de cirugía menor de oftalmología, otorrinolaringología, dermatología o traumatología.

De todos ellos se obtuvo una muestra de sangre para el estudio genético, y de un subgrupo de 366 pacientes con historia de VTE y sin terapia cumarínica, y en un subgrupo de 451 sujetos sanos, procedentes todos ellos del Hospital Universitario La Fe, fue posible obtener sangre anticoagulada con citrato, para la obtención de plasma con el cual realizar las determinaciones de diversos parámetros plasmáticos.

3.1.1.2.1. Análisis funcional del polimorfismo C1418T del gen de la trombomodulina: aislamiento, cultivo y genotipado de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVECs)

Puesto que las células endoteliales de la pared vascular sintetizan y exponen trombomodulina (TM) en su superficie, aislamos y cultivamos células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) con el fin de analizar la funcionalidad del polimorfismo C1418T del gen de la TM. Para ello, genotipamos las células para el polimorfismo C1418T, y cuantificamos los niveles de TM tanto en el sobrenadante de los cultivos, que equivaldría a la TM soluble (sTM) presente en la circulación sin actividad cofactora para la activación de la proteína C, como en el extracto celular, que equivaldría a la TM anclada en la membrana de la célula, encargada de la unión a trombina, y responsable de la activación de la proteína C in vivo.

Las HUVECs se aislaron de cordones umbilicales humanos de acuerdo con la técnica descrita por Martínez-Sales y colaboradores (2007). Brevemente, las HUVECs se obtuvieron por digestión con colagenasa y posterior cultivo en frascos T-25 recubiertos con factor de adhesión endotelilal (Endothelial Cell Attachment Factor. Sigma-Aldrich Co, Alemania), en medio 199 con HEPES 15 mM, suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 20%, factor de crecimiento endotelial al 1%, L-glutamina 2 mM, piruvato sódico 1 mM, penicilina 50 U/ml, y 50 µg/ml de sulfato de estreptomicina en una atmósfera de 95% aire-5% CO2. Los subcultivos se obtuvieron a partir de monocapas confluentes del cultivo primario, tratadas con tripsina 0,25% y EDTA 0,01% en tampón fosfato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 (PBS). Todas las experiencias se realizaron en el primer o segundo subcultivo.

Las células se identificaron como endoteliales por su típica forma de canto rodado y por la presencia de factor von Willebrand, confirmada por un método inmunocitoquímico utilizando anticuerpos anti-von Willebrand humano de conejo (Dako, Alemania).

Así, a partir de un cultivo primario de HUVECs, se recogieron entre 600.000 y 1.000.000 células para el estudio de biología molecular que, tras su lavado y almacén en nitrógeno líquido, se guardan hasta el momento de su análisis. La extracción de DNA genómico para el genotipado de las células para el polimorfismo C1418T del gen de la TM, se realizó empleando el kit comercial Wizard Genomics DNA Purification Kit (Promega, Innogenetics), siguiendo las

indicaciones del fabricante. El resto de cultivo primario se sembró en placas de 96 pocillos, con 15.000-20.000 células por pocillo, y en medio de cultivo con 20% de SBF. Cuando alcanzaron confluencia, se cambió el medio de cultivo con 2% de SBF y sin antibióticos. A continuación, de cada primer subcultivo para cada cordón se hicieron incubaciones sin y con trombina a 1 U/ml durante 3 horas por quintuplicado. Finalmente, se cuantificó por una parte, la TM presente en el sobrenadante recogido o liberado celular, y por otra parte, la TM presente en el contenido celular para cada tipo de subcultivo en condiciones basales o estimuladas con trombina, respectivamente. La obtención del contenido celular se realiza mediante incubación en agitación de 2 h a 4ºC de las células endoteliales con tampón de lisis (Tris 20 mM, ClNa 100 mM, TritonX-100 al 1% y

fenilmetilsulfonilfluoruro 1 mM; pH 7,5), obtenieno el lisado celular, al que someteremos a tres ciclos de congelación y descongelación, finalmente.

3.1.1.3. IDENTIFICACIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN DE LA GLUCOSILCERAMIDA SINTASA (UGCG), Y SU ASOCIACIÓN CON LOS NIVELES PLASMÁTICOS DE GlcCer, PROTEÍNA C ACTIVADA Y RIESGO DE TROMBOEMBOLISMO VENOSO

Para la realización de este estudio se reclutaron pacientes que habían sufrido, al menos, un episodio de VTE, a partir del registro de pacientes remitidos al Hospital Universitario La Fe para realizar un estudio de trombofilia entre octubre de 1997 y noviembre de 2005.

Un total de 316 pacientes caucásicos satisfacían todos los criterios de inclusión y accedieron a participar en el estudio (163 mujeres y 153 hombres), con una edad media de 42 años (40 años en el grupo de mujeres y 44 años en el grupo de hombres).

Los individuos del grupo control fueron reclutados junto con el grupo de pacientes entre el personal del Hospital Universitario La Fe, familiares o amigos de éstos, o entre individuos que venían a realizarse pruebas pre-operatorias para intervenciones de cirugía menor de oftalmología, otorrinolaringología, dermatología o traumatología. Este grupo estaba formado por 320 individuos caucásicos voluntarios no relacionados entre sí, de edad y sexo similar al de los pacientes (177 mujeres y 143 hombres), con una media de edad de 40 años (40 años para el grupo de hombres y 41 años para el de mujeres), y de la misma región geográfica. Todos ellos estaban aparentemente sanos y ninguno presentaba historia personal o familiar de trombosis.

De todos ellos se obtuvo una muestra de sangre para el estudio genético, y otra de sangre anticoagulada con citrato, para la obtención de plasma con el cual realizar la determinación de GlcCer y APC.