Los cebadores se diseñaron a partir de la secuencia del gen completo, BnPME, obtenida de la base de datos NCBI (Nº. acceso: AY036606) (Fig.3.12.).
5´- ATGTCTCAAATTTTCATGTTCTTGGTCACCCTTAGCTTCTTCTCCATATTGTCATCTCCTTCTCTCGCCGCA GGACCTCAGGCCACAGGAAACGCCACGTCCCCATCAAATGTATGTCGCTACGCACCGGATCCATCTTACTGTAGATCAGT TCTCCCAAACCAGCCCGGAGATGTTTACTCCTACGGTCGTTTCTCTCTCAGACGGTCCATCTCACGTGCCAGGCGGTTCA TCTCAATGATCGACTATCAACTAAACCGGAAAGGCAAAGTGGATGCTAAATCCACCTTGCGGGCACTCGAAGACTGCAAA TTCCTAGCCAGCCTTACTATAGACTTCCTCCTTAGTAGCTCACAGACCGTAGATGCCACCAAAACGCTGTCGGTTTCGAG GGCTGACGATGTTCATACTTTCCTAAGTGCTGCGATCACCACGAACAGACTTGCCTTGAAGGACTTAAATCCACGGCATC TGAAAATGGTCTCTCTGGTGATCTTTACAACGATACAAAACTCTATGGGGTCTCTCTTGCCCTCTTTTCCAAAGGTTGGG TGCCAAAAAGGAAAAGATCGAGGCCGGTTTGGAAACCAGAAGCCAGCTTCAAAAAGTTTTCCGGCTTCCGTAACGGTAGA TTACCGTTAAAGATGACGGAAAGGACGCGTGCCGTTTACAACACCGTGACTAGGTCTGGGAGAAAGCTTCTCCAAACTGG AGTAGACGCTGTTCAGGTCAGCGATATCGTGACGGTGAATCAGAACGGGACGGGAAACTTCACGACTATAAACGAAGCT GTAGCTGCCGCGCCTAATAAAACTGACGGTAGTAACGGTTATTTCTTGATCTACGTAACGGCGGGATTGTACGAGGAATA CGTGGAGATTCCGAAGTACAAGAGGTATGTGATGATGATCGGTGACGGCATTAACCAAACTGTTATCACCGGAAACCGGA GCGTCGTTGATGGATGGACCACTTTCAAGTCCGCCACATTTATTCTAACAGGTCCTAACTTTATTGGCGTGAACATAACA ATCCGCAACACGGCAGGACCAACCAAGGGTCAAGCCGTCGCATTGAGGAGCGGTGGAGACTTCTCTGTATTCTATAGTTG TAGTTTCGAAGCCTATCAAGATACCTTATATACGCATTCTCTCAGACAGTTCTATCGTGAATGTGATGTTTATGGTACGG TTGACTTTATATTCGGCAATGCTGCAGTGGTGTTACAAAAGTGTAATTTGTATCCACGTCAGCCTCGTCAAGGTCAGGCG AACGAGGTTACAGCTCAAGGTCGTACCGACCCGAACCAGAACACTGGAACTGTGTTACATGGGTGTACAATAAGACCCGC GGATGATTTGGCTTCGAGCAACTATACAGTAAAAACTTATCTTGGTCGGCCGTGGAAGGAATATTCGAGAACCGTTGTTA TGCAGACTTACATAGACGGGTTTCTTGACCCGACTGGCTGGAACGCATGGTCTGGAAATTTCGCATTGAGCACACTTTAC TATGCGGAATACAATAACACAGGACCTGGTTCTAGCACGACAAACAGAGTCACTTGGCCAGGTTATCATGTCATTAACGC TACTGATGCTTCAAATTTCACCGTCACCAATTTTCTTGTTGGCGAAGGTTGGATCGGACAAACCGGGGTGCCTTTCGTGG GTGGAATGATTGCATAA-3´
El diseño del oligonucleótido directo (5´-3´) se realizó a partir de las 20 bases del extremo N-terminal de la secuencia de la proteína de interés, incluyendo el codón de iniciación. No obstante, al emplearse la tecnología Gateway, fue necesario añadir una secuencia de 4 bases, CACC, en el extremo 5´del cebador, necesaria para la correcta inserción en el vector de clonación (Tabla 17).
Secuencias 5´-3´ Codon STOP NºBases
F-Oligonucleótido CACCATgTCTCAAATTTTCATgTTCTTg NO 28
R1-Oligonucleótido CGTGGGTGGAATGATTGCA NO 19
Tabla 18. Secuencia de oligonucleótidos empleados
Por otro lado, se diseñó un oligonucleótido reverso a partir de las 20 bases del extremo C-terminal de la secuencia de la proteína de interés sin incluir el codón stop 5´TAA´3 (Tabla 17).
3.10.1.2PCR Touchdown
Debido a la mala calidad de los cebadores diseñados, se tuvo que recurrir a un tipo especial de PCR, PCR Touchdown (Nature Protocols 3, 1452 - 1456 (2008)) para incrementar la especificidad y la sensibilidad de la amplificación.
La PCR touchdown, se basa en el empleo de una temperatura de hibridación decreciente en 1ºC en cada ciclo, hasta alcanzar una temperatura, que se mantiene en los últimos ciclos.
La reacción de amplificación se llevó a cabo en tubos de 0,2 ml en un volumen final de reacción de 50 µl; la mezcla de PCR contenía 50-100 ng de cDNA, 10 µl de una mezcla de dNTPs 10mM (dATP, dTTP, dCTP y dGTP), 1 µl de cada cebador (10µM), 5 µl de tampón de amplificación 10x “High Fidelity” (Invitrogen), 1µl de MgSO4 (50mM)(Invitrogen) y 0,2 µl de la enzima “Taq DNA Polimerase High Fidelity Platinum” (5U/µl (Invitrogen).
La PCR se llevó a cabo en un termociclador Eppendorf.
1º Fase:
1º Etapa Desnaturalización inicial 98ºC 3 min
2º Etapa
15 ciclos
Desnaturalización 98 ºC 30seg
Hibridación 65-50ºC* 45seg
Extensión 72 ºC 2 min
*Tª Hibridación desciende 1ºC en cada ciclo, hasta un total de 15 ciclos
2º Fase: 1º Etapa 20 ciclos Desnaturalización 98 ºC 30 seg Hibridación 65 ºC 45 seg Extensión 72 ºC 2 min
2º Etapa Extensión final 72 ºC 10 min
Tabla 19. Programa de PCR touchdown empleado.
Finalizada la PCR, se realizó una electroforesis en gel de agarosa (Apartado 3.8.2.4). Y se procedió a cortar la banda correspondiente al gen BnPME, con el kit comercial “QIAquick® Gel Extraction” (Qiagen) (Apartado 3.8.2.5).
3.10.1.3Clonación en el vector pENTRTM/D-TOPO®
Tras la purificación del gen BnPME, se procedió a su ligación en el vector de clonación pENTRTM/D-TOPO® de Invitrogen. A esta reacción de la conoce como “Topo cloning reaction”.
Este vector se caracteriza por contener una secuencia de 4 bases, GTGG, que se va a unir específicamente con la secuencia CACC, añadida en el extremo 5´del cebador directo; de manera que el producto de PCR, entra en el vector con la orientación correcta con una eficacia del 90%. (Figura 3.13)
Además, este vector también consta de un gen de resistencia a Kanamicina, que permitió su selección posterior.
3.13. Mecanismo de clonación en el pENTRTM/D-TOPO® de Invitrogen (Gateway® technology)
Para optimizar las reacciones, se empleó una relación estequiométrica vector: inserto de 1:2.
Se emplearon 20 ng de plásmido, el fragmento de cDNA, y 1µl de solución salina, en un volumen final de 6 µl, siguiendo las indicaciones de la casa comercial.
La mezcla se incubó durante 5 min a temperatura ambiente, quedando así el fragmento introducido y correctamente orientado en el vector (Figura 3.13).
3.10.1.4Transformación de bacterias competentes
En este caso, se emplearon las células competentes E.coli, One shot® MatchTM T1R, incluidas en el kit “pENTRTM Directional TOPO® Cloning kit” (Invitrogen). Al igual que en el apartado 3.8.2.7, las bacterias se transformaron mediante choque térmico, según el método descrito por Lucotte y Baneyx (1993).
Se empleó 2 µl de la ligación anterior por cada vial de bacterias, de 50 µl. Se siguió el protocolo descrito en el apartado 3.8.2.7.
Finalmente, se sembró 100 µl de cada tubo en placas Petri con medio LB y kanamicina (50 µg/ml) y se incubaron a 37ºC durante toda la noche.
Al día siguiente, se obtuvo un crecimiento con un gran número de colonias bien aisladas en cada placa.
Al igual que en el apartado 3.8.2.8, a continuación se procedió al análisis de las colonias crecidas. Dicho análisis, se realizó mediante PCR en colonia utilizando los cebadores que flanquean al gen BnPME, empleados para la obtención del fragmento clonado (Tabla 17).
Una vez seleccionadas las colonias positivas, se realizaron cultivos en tubos de ensayo de LB líquido y kanamicina (50 µg/ml) como se explicó en el apartado3.8.2.9.
3.10.1.5Aislamiento del DNA plasmídico
A partir de estos cultivos se realizó el aislamiento del DNA plasmídico (Miniprep) mediante el empleo del kit comercial “Wizard Plus SV Minipreps, DNA Purification Systems” (Promega) (Apartado 3.8.2.9).
Finalizado el aislamiento, se comprobó la concentración y la pureza del DNA extraído tal y como se explicó en el apartado 3.5.3. Las muestras se conservaron a - 20ºC.
3.10.1.6Secuenciación de los clones
Una vez chequeado el DNA plasmídico obtenido, antes de mandar a secuenciar la construcción, se realizaron nuevas pruebas para confirmar la presencia del fragmento clonado en el DNA plasmídico purificado.
Esta comprobación se llevó a cabo de dos formas posibles:
3.10.1.6.1Comprobación del inserto mediante digestión simple:
Mediante una digestión simple con la enzima de restricción Ksp I (Sac II) (Roche Applied Science) empleando 5 µl de la muestra de DNA plasmídico obtenido, 5 µl de tampón L y 20 µl de enzima Ksp I para un volumen final de 50 µl, según el protocolo de la casa comercial. A continuación, la mezcla se incubó a 37ºC durante 2 -3 h.
3.10.1.6.2Comprobación del inserto mediante PCR:
También se realizaron varias pruebas de PCR empleando diferentes parejas de cebadores para asegurar el resultado.
Nombre Cebador directo (5´-3´)
Cebador inverso (5´-3´)
Tamaño (pb)
PAREJA 1 GGAGCGTCGTTGATGGATGG AGGCGAACGAGGTTAC 327
PAREJA 2 GGAGCGTCGTTGATGGATGG CGTGGGTGGAATGATTGCA 738
PAREJA 3 CACCATGTCTCAAATTTTCATGTTCTTG AGGCGAACGAGGTTAC 1289
Tabla 20. Parejas de oligonucleótidos empleadas para la comprobación del inserto.
La reacción de amplificación se llevó a cabo en tubos de 0,2 ml en un volumen final de reacción de 25 µl; la mezcla de PCR contenía 50-100 ng de cDNA, 10 µl de una mezcla de dNTPs 10mM (dATP, dTTP, dCTP y dGTP), 1 µl de cada cebador (10µM), 2,5 µl de tampón de amplificación 10x “HotMaster™ Taq con Mg2+” (Eppendorf) y 0,25 µl de la enzima “Hot Master Taq polimerasa” (5U/ µl)(Eppendorf).
La PCR se llevó a cabo utilizando el programa detallado en la (Tabla 19).
1º Etapa Desnaturalización inicial 94ºC 2 min
2º Etapa
40 ciclos
Desnaturalización 94 ºC 40seg
Hibridación 50 ºC 1min
Extensión 65 ºC 2 min
3º Etapa Extensión final 65 ºC 10 min
Tabla 21. Programa de PCR empleado.
Una vez identificados los clones correctos, se procedió a la secuenciación de los mismos, en el servicio de secuenciación Secugen, para confirmar que el gen de interés se había clonado con la correcta orientación. Para ello, se empleó la pareja
de cebadores M13 directo y reverso, incluida en el kit “pENTRTM Directional TOPO® Cloning kit” (Invitrogen)
3.10.1.7Clonación en el vector de destino
Una vez recibido el informe de secuenciación de la construcción y comprobar que todo era correcto, se procedió a la clonación de dicha construcción en el vector destino pF7KWG2 T-DNA (Fig.3.14).
Este vector está diseñado de tal forma, que el fragmento clonado en TOPO, entra por recombinación homóloga en el extremo 5’ del gen de la proteína verde fluorescente (GFP) insertada en el plásmido, de forma que cuando se inserte en el genoma de la planta y se transcriba y traduzca con la maquinaria de la misma, se expresará una proteína verde fluorescente que irá a la localización propia de la proteína PME.
3.14. Vector utilizado para proteínas de fusión con GFP
Se empleó una relación estequiométrica 2: 1 PME-TOPO: vector destino en un volumen de 8 µl. A continuación, se añadió 2 µl de la enzima “LR clonasa II” (Invitrogen) previamente descongelada en hielo. Después de mezclar bien la reacción, se incubó durante 1-2 h a temperatura ambiente.
Transcurrido este tiempo, se añadió 2 µg de la solución de proteinasa K incluida en el kit. Por último, la mezcla de incubó a 37ºC durante 10 min.
3.15. Obtención del vector de expresión (Gateway® technology)
A continuación, se procedió a la transformación de E.coli con el resultado de la ligación.
Se siguió el protocolo de transformación descrito en el apartado 3.8.2.7 empleando 1 µl del resultado de la ligación.
Finalizada la transformación, se sembraron 20 µl de cada transformación en placas Petri de LB y Estreptomicina (50 µg/ml).
Tras una noche de crecimiento a 37ºC, aparecieron varias colonias aisladas. Se seleccionaron 5 colonias y se procedió al chequeo del inserto mediante PCR en colonia.
3.10.1.8Aislamiento del DNA plasmídico
Las colonias positivas, se ponen cultivo en LB líquido y estreptomicina (50 µg/ml) y se incubó a 37ºC en agitación durante toda la noche.
A partir de cada colonia positiva seleccionada, se inoculó tubos de ensayo con 3 ml de LB líquido y estreptomicina (50 µg/ml), y se mantuvieron en agitación a 190 rpm y 37ºC hasta que alcanzaron una densidad óptica de 0,6 a 600 nm (12-16 h). A partir de estos cultivos se inició el aislamiento del DNA plasmídico (Miniprep) utilizando un protocolo basado en el empleo de 3 tampones diferentes, más adecuado para el aislamiento de DNA plasmídico de gran tamaño, que el kit de Promega empleado en los casos anteriores.
Los cultivos líquidos crecidos durante toda la noche, se centrifugaron a 13000 rpm a 4ºC durante 5 min. Se descartó el sobrenadante y se añadió 250 µl del tampón 1 (EDTA 1mM, Tris 50mM pH 8.0) y 2,5 µl RNasa A. La mezcla se agitó en vórtex y se incubó durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, se
añadió 250 µl del tampón 2 (NaOH 0,2Nm SDS 1%) y se mezcló suavemente mediante inversión del tubo varias veces. Se incubó 5 min a temperatura ambiente y se añadió 350 µl de tampón 3 (Acetato potásico 3M, ácido acético 1,8M, pH 5,5). De nuevo, se mezcló por inversión del tubo y se incubó durante 10 min en hielo. Transcurrido este tiempo, las muestras se centrifugaron a máxima velocidad durante 10 min, a 4ºC. Se tomó 750 µl del sobrenadante y se puso en un tubo eppendorf 1,5ml. Se añadió 750 µl de isopropanol y se mezcló bien. A continuación, se centrifugó a 14000 rpm durante 30 min a 4ºC. Se eliminó el sobrenadante y se centrifugó de nuevo a 14000rpm durante 10min.
Tras descartar el sobrenadante, las muestras se mantuvieron a 37ºC durante 10 min. Por último, se añadió 50 µl de agua destilada estéril.
Se analizó la concentración y pureza del DNA extraído del modo descrito en el apartado 3.5.3.
Una vez chequeado el DNA plasmídico obtenido, antes de proceder al siguiente paso, se realizaron nuevas pruebas para confirmar la presencia del fragmento clonado en el DNA plasmídico purificado. Esta comprobación se llevó a cabo de de la misma forma que se explicó en el apartado 3.10.1.6.2