A continuación, nos propusimos determinar cuál era el tamaño mínimo necesario de dsRNA que se precisa para la formación del complejo con la proteína hVP3. Para llevar a cabo este análisis, se inmovilizó un dsRNA biotinilado de 24 nt en una celda, y como control se empleó una celda de flujo vacía. En un primer análisis se inyectó la proteína hVP3 a una concentración de 20 nM con un tiempo de contacto de 2 min. A continuación se inyectó tampón 1M NaCl, 50 mM NaOH durante 20 s para deshibridar el dúplex dsRNA, quedando únicamente sobre la superficie del chip la hebra biotinilada de cadena sencilla. Se comprobó que había perdido su capacidad de unir el analito inyectando la proteína hVP3 a una concentración de 10 mM, 5 veces superior a la empleada anteriormente, no observándose la formación del complejo (datos no mostrados).
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Figura 22. Esquema explicativo de los distintos procedimientos empleados en el ensayo. A. Unión del dímero hVP3 al ligando 24 nt-dsRNA. Moléculas biotiniladas de 24 nt-dsRNA son capturadas en la
superficie del chip de estreptavidina. Posteriormente, se inyecta la proteína hVP3 purificada a una concentración de 20 nM con un tiempo de contacto de 2 min. B. Deshibridación del dúplex RNA en la
superficie del chip. Se inyecta un tampón 1M NaCl, 500 mM NaOH durante 20 s en la superficie del chip y se
obtiene la deshibridación del dúplex RNA quedando únicamente la hebra biotinilada unida al chip. C y D.
Hibridación de la hebra sencilla biotinilada de 24 nt con moléculas ssRNA de diferentes longitudes.
Moléculas de ssRNA de 21 nt (C) o 15 nt (D) complementarias a la hebra biotinilada unida al chip desde su extremo 5’, se inyectan a una concentración de 500 nM durante 2 min. A continuación, se inyecta la proteína hVP3 purificada.
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Posteriormente, se inyectaron moléculas de RNA de cadena sencilla (ssRNA) de diferentes longitudes (24, 21, 19, 17, 15, 13, 11 y 9 nt) –y complementarias desde el extremo 5’ a la secuencia biotinilada que permanece unida a la superficie del chip-, a una concentración de 500 nM durante 2 min. A continuación, se inyectó una concentración constante de proteína hVP3 (20 nM) durante 2 min para determinar si la unión de dicha proteína al ácido nucleico se veía afectada por la longitud de la cadena complementaria de ssRNA, la cual previamente se había hibridado a la cadena biotinilada unida a la superficie del chip a través de su extremo 5’, dejando los nucleótidos no apareados hacia el exterior. En la figura 22 se muestra un esquema explicativo de los procedimientos realizados.
Al inyectar ssRNA de 24 nt, se observó una recuperación de la señal de unión del ligando al chip a niveles similares a los obtenidos antes de la regeneración, con una capacidad de unión de la proteína hVP3 similar a la observada con el dsRNA original de 24 nt (datos no mostrados). Por otro lado, se observó que la disminución de la longitud del ssRNA inyectado para realizar la hibridación y formación de nuevos dúplex RNA sobre la superficie del chip, provoca una caída del nivel de unidades de resonancia (RUs) inmovilizadas. Esta disminución es atribuible a la menor masa molecular de los ssRNAs empleados o a una posible degradación del RNA durante la regeneración del chip. El RNA resultante forma una doble cadena incompleta puesto que la cadena complementaria biotinilada y unida al chip mantiene los 24 nt originales. Así mismo, la formación del complejo se ve afectada por la disminución del tamaño del oligonucleótido, produciéndose una menor interacción con VP3.
Los resultados obtenidos se muestran en la figura 23. En el gráfico se muestran los moles de proteína hVP3 unida a la superficie del chip en porcentaje normalizado frente a los moles de dúplex RNA pegados al chip en cada caso. Observamos que al hibridar un ssRNA de 21 nt a la hebra biotinilada de 24 nt, la cantidad de proteína hVP3 que se une a este dúplex de RNA es un 50% inferior a la observada con el dúplex RNA de 24 nt. La cantidad de proteína unida se mantiene en cantidades similares en el caso de los dúplex de 19 y 17 nt. Por lo tanto, en base a estos resultados, la disminución de entre 3 y 7 nt en la longitud del dsRNA regenerado en la superficie del chip provoca
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una disminución de la interacción del 50% lo que podría ser atribuible a la desaparición de un sitio de unión a la proteína hVP3 en el dsRNA.
Figura 23. Unión de hVP3 a moléculas de diferentes longitudes de dsRNA biotinilado presentes en la superficie del chip. Se muestra la cantidad relativa de moles de hVP3 unida por moles de dsRNA en porcentaje.
Por otra parte, al regenerar los dúplex RNA de la superficie del chip con moléculas ssRNA de 15, 13, 11 o 9 nt, observamos que la cantidad de proteína unida disminuye un 30% respecto de la cantidad unida a los dúplex RNA de 17, 19 o 21 nt, y más de un 80% respecto de la cantidad unida al dúplex RNA de 24 nt. Por el momento desconocemos si la marcada disminución en la cantidad de proteína unida a los dúplex RNA más pequeños se debe a una pérdida de afinidad de la proteína o a la desaparición de otro sitio de unión en el dsRNA.
Hemos podido observar que la interacción con el dímero hVP3 ocurre con todos los tamaños de dsRNA empleados en el ensayo. Incluso en el caso del dúplex RNA de 9 nt, se observa una señal que, aunque no muy alta, es superior a la detectada en la celda de referencia, lo que indica que se produce la interacción. Tal y como conocemos por los resultados del apartado 4.6.1., un dsRNA de 8 nt no es suficiente para que se detecte la interacción entre hVP3 y dicho dsRNA. Sin embargo, en base a los resultados obtenidos en este último ensayo, podemos interpretar que el tamaño mínimo de dúplex RNA suficiente para que ocurra la interacción hVP3-dsRNA sería de 9 nt cuando una de las dos cadenas de RNA es de mayor longitud.
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4.6.3. Análisis de la contribución de cada residuo del motivo Patch1 en la unión al