System usage by condition

β−glucanasas.

Las hidrolasas del β-glucano de origen fúngico han sido objeto de estudio de varios grupos de investigación desde hace años. Ya se ha comentado en los resultados de esta memoria la elevada similitud de las proteínas codificadas por los genes CaENG1 y CaENG2 con las proteínas ScEng1p y ScEng2p de S. cerevisiae, Engl1p de A. fumigatus y SpEng1p y SpEng2p de S. pombe que hemos clasificado como endo-β-1,3-glucanasas. Esta actividad ha sido demostrada en el caso de las proteínas de S. cerevisiae y de la proteína de A. fumigatus y será necesario confirmarla en el resto de las proteínas.

CaEng1p y ScEng1p presentan un péptido señal en el extremo aminoterminal, característico de aquellas proteínas que entran en la ruta de secreción. Además, las dos proteínas poseen un dominio rico en residuos de serina y treonina, típico de las proteínas que se anclan a la membrana plasmática o de aquellas que se secretan al exterior celular. Teniendo en cuenta estos rasgos comunes y conociendo experimentalmente que ScEng1p se secreta mayoritariamente al espacio periplásmico y luego al medio de cultivo (Baladrón García 1997), podríamos especular que CaEng1p codifica una endo-β-1,3-glucanasa que fundamentalmente es secretada al espacio periplásmico y posteriormente al medio de cultivo. Análogamente, CaEng2p, al igual que su homólogo en S. cerevisiae no presenta una región hidrofóbica en el extremo aminoterminal indicativo de la existencia de una secuencia señal, ni tiene una región rica en residuos de serina y treonina. Puede hipotetizarse que CaENG2 codifica una endo-β-1,3-glucanasa aunque serían necesarios estudios de actividad hidrolítica utilizando compuestos como laminarina (sustrato lineal de β-1,3-glucano) (Molina et al. 1987) y pustulán (sustrato lineal de β-1,6-glucano) para comprobar, en primer lugar, que se trata de glucanasas y en segundo lugar, la especificidad del enlace que hidrolizan. También se requerirían experimentos de actividad hidrolítica empleando pNPG (compuesto hidrolizable por enzimas de tipo β-glucosidasa) (Molina et al. 1987) y laminarina oxidada para confirmar la posible actividad endohidrolítica. Este compuesto

tiene bloqueado el extremo no reductor de las moléculas por oxidación con periodato, lo que impide su ataque por parte de enzimas que retiren restos de glucosa a partir de este extremo -exoglucanasas- y solamente es hidrolizado por enzimas capaces de romper enlaces internos de la molécula –endoglucanasas.

Puesto que disponemos de una cepa de C. albicans delecionada en tres glucanasas: ∆eng1 ∆eng2 xog1, ensayos de actividad glucanásica en fracciones de paredes celulares, sobrenadantes de extractos celulares y sobrenadantes de caldos de cultivo de esta estirpe transformada, bien con CaENG1 bien con CaENG2, nos permitiría conocer la localización de cada proteína y valorar la aportación individual de las mismas a la actividad glucanásica. También sería deseable la purificación de ambas proteínas, lo que permitiría una confirmación de diversos aspectos como la posible existencia de un procesamiento proteolítico, el procesamiento del péptido señal, la determinación del peso molecular de la proteína madura, etc.

Como ya se mencionó en el apartado de Resultados, respecto al grupo de las exo-β-1,3-glucanasas de levaduras, la única homología significativa de CaEng1p y CaEng2p corresponde a dos aminoácidos que son considerados como pertenecientes al centro de unión al sustrato: la segunda histidina y la tirosina del bloque D-H-H-H-Y (Esteban et al. 1999), aunque con una ligera modificación al estar intercalada una fenilalanina entre la segunda y tercera histidina (D-H-H-F-H-Y). En la figura 60 se ha alineado la región correspondiente a esta secuencia en varias β-glucanasas para mostrar que, curiosamente, en las proteínas CaEng1p y CaEng2p, este bloque presenta “características híbridas” de modo que, por una parte, se respetan las tres histidinas presentes en las exo-β-1,3-glucanasas y, por otra parte, aparece la fenilalanina intercalada como en las 1,4-glucanasas (celulasas).

En todas las endo-β-1,3-glucanasas mencionadas aparece la fenilalanina intercalada aunque, curiosamente, la segunda histidina que se encuentra conservada en todas las exo y endo-β-1,3-glucanasas de levaduras ha sido reemplazada por ácido aspártico en CaEng1p y la tirosina que también aparece conservada en todas las exo y endo-β-1,3-glucanasas de levaduras se encuentra reemplazada por un triptófano en SpEng2p. Hasta el momento no disponemos de datos que nos permitan afirmar que CaEng1p posee actividad β-1,3-glucanasa y pudiera suceder que la sustitución de la histidina por el ácido aspártico haya tenido consecuencias sobre la actividad de la proteína, de modo que CaEng1p sea incapaz de actuar sobre β-1,3-glucano, y por eso no se puede apreciar ningún fenotipo al delecionar únicamente el gen CaENG1. En cualquier caso, serían necesarios experimentos de mutagénesis dirigida para confirmar estas hipótesis.

Basándonos en los análisis de secuencias aminoácidicas llevados a cabo y en todas las observaciones experimentales realizadas en algunas de las endo-β-1,3-glucanasas, es posible especular que, al igual que las exo-β-1,3-glucanasas constituyen una familia de proteínas altamente conservadas en levaduras, las proteínas CaEng1p y CaEng2p junto a sus homólogos en S. cerevisiae, S. pombe y A. fumigatus, pudieran ser miembros de otro grupo de enzimas con actividad sobre el β-glucano. De

hecho, al finalizar la escritura de esta memoria, se ha advertido que el servidor sobre las enzimas que actúan en carbohidratos (CAZy) (http://afmb.cnrs- mrs.fr/~pedro/CAZy/db.html) ha actualizado sus datos incluyendo una nueva familia de glicosil hidrolasas, la número 81, que está integrada por enzimas con actividad endo-β-1,3-glucanasa, y que incluye las dos endoglucanasas de S. cerevisiae (YNR067c y YLR144c), las dos de S. pombe (SPAC23D3.10c y SPAC821.09), las dos de C. albicans (CaENG1 y CaENG2), la β-1,3-glucanasa de A. fumigatus, dos proteínas de Arabidopsis thaliana (F15H18.17 y F1N13_10) y una proteína de la planta de soja que interacciona con un compuesto de β-glucano de la pared celular de un hongo fitopatógeno (β-glucan-elicitor receptor).

Por otro lado, ScEng2p identificada también como Acf2p o Pca1p (Lechler and Li 1997), presenta una zona rica en residuos de prolina en el extremo N-terminal que serían posibles dominios SH3 y que también aparece en CaEng2p. Además, ScEng2p posee en el extremo C-terminal dos dominios tipo “pleckstrin” (PH) Usando el programa bioinformático SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/) para la búsqueda de dominios proteicos definidos, no se ha localizado ningún dominio tipo PH en CaEng2p, lo que no confirma su inexistencia, ya que podría ocurrir que los posibles dominios PH no se ajustasen exactamente a la secuencia consenso establecida. De hecho, de los dos dominios tipo “pleckstrin” que se localizan en Pca1p, solo uno de ellos coincide con la secuencia consenso. Resulta atractivo especular que CaEng2p pudiera también tener un papel relevante en la polimerización de la actina. El citoesqueleto de actina es importante tanto para el crecimiento celular como para el mantenimiento de la forma. Los diferentes procesos morfogenéticos requieren que la maquinaria que controla la dinámica cortical de la actina sea capaz de responder a las señales celulares, de localizarse en regiones específicas de la corteza celular y de polimerizar los filamentos de actina para formar super-estructuras. Estos procesos implican que en los lugares donde tiene lugar la polimerización de actina existan grupos de proteínas constituidos, no sólo por aquellas proteínas estructurales que modulan el comportamiento dinámico de los filamentos de actina, sino también por proteínas que puedan integrar las señales procedentes de varias cascadas reguladoras.

Serán necesarios estudios posteriores para verificar la posible implicación de CaEng2p en estos procesos.

Saccharomyces cerevisiae Exg1p D H H - H Y Saccharomyces cerevisiae Exg2p D H H - H Y Saccharomyces cerevisiae Ssg1p D H H - H Y

Candida albicans Xog1p D H H - H Y

Saccharomyces cerevisiae Eng1p D H H F H Y Saccharomyces cerevisiae Eng2p D H H F H Y Candida albicans Eng1p D H D F H Y

Candida albicans Eng2p D H H F H Y

Schizosaccharomyces pombe Eng3p D H H F H Y Schizosaccharomyces pombe Eng2p D H H F H W Aspergillus fumigatus Engl1p D H H F H Y Erwinia chrysanthemi EGEC T L H F - Y Clostridium thermocelum EGCT N F H F - Y Clostridium acetobutylicum EGCA T C H F - Y Saccharomyces cerevisiae Exg1p D H H - H Y Saccharomyces cerevisiae Exg2p D H H - H Y Saccharomyces cerevisiae Ssg1p D H H - H Y

Candida albicans Xog1p D H H - H Y

Saccharomyces cerevisiae Eng1p D H H F H Y Saccharomyces cerevisiae Eng2p D H H F H Y Candida albicans Eng1p D H D F H Y

Candida albicans Eng2p D H H F H Y

Schizosaccharomyces pombe Eng3p D H H F H Y Schizosaccharomyces pombe Eng2p D H H F H W Aspergillus fumigatus Engl1p D H H F H Y Erwinia chrysanthemi EGEC T L H F - Y Clostridium thermocelum EGCT N F H F - Y Clostridium acetobutylicum EGCA T C H F - Y

Figura 60: Bloque de histidinas: D-H-H-H-Y.

Comparación de la secuencia de aminoácidos de una zona que interviene en el supuesto centro de unión al sustrato de las exo-β-1,3-glucanasas y las endo-β-1,3- glucanasas de S. cerevisiae y C. albicans, las endo-β-1,3-glucanasas de S. pombe y A. fumigatus, y algunas endo-β-1,4-glucanasas de la familia A de celulasas.