Suele ser más difícil de efectuar la valoración de enzimas cuyas reacciones no se acompañan de un cambio de la absorbancia o de la fluorescencia. En ocasiones es posible transformar el pro ducto o el sustrato restante en un compuesto que se detecta con mayor facilidad. En otros casos, antes de la medición, el produc to de la reacción quizá tenga que separarse de sustrato que no ha reaccionado. Una estrategia alternativa es crear un sustrato sin tético cuyo producto absorbe luz o muestra fluorescencia. El
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fIgura 7–9 Observación directa de eventos de división de Dna único catalizados mediante una endonucleasa de restricción.
Moléculas de DNA inmovilizadas a cuentas (amarillo claro) se colocan en un chorro de amortiguador que fluye (flechas negras), lo que hace que adopten una conformación extendida. la división en uno de los sitios de restricción (anaranjado) por una endonucleasa lleva a un acortamiento de la molécula de DNA, que puede observarse de manera directa en un microscopio porque las bases de nucleótido en el DNA son fluorescentes. Aunque la endonucleasa (rojo) no muestra fluorescencia y, por ende, es invisible, la manera progresiva en la cual se acorta la
molécula de DNA (1 → 4) revela que la endonucleasa se une al extremo
capítulO 7 Enzimas: mecanismo de acción 65
pnitrofenilo fosfato, por ejemplo, es un sustrato artificial para ciertas fosfatasas y para quimotripsina, que no absorbe luz visi ble; sin embargo, después de la hidrólisis, el anión pnitrofenila to resultante absorbe luz a 419 nm.
Otro método bastante común es emplear una valoración “acoplada” (figura 7-11); por lo común una deshidrogenasa cuyo sustrato es el producto de la enzima de interés se añade en exceso catalítico. El índice de aparición o desaparición de NAD(P)H depende entonces del índice de la reacción enzimáti ca a la cual se ha acoplado la deshidrogenasa.
eL anáLIsIs de cIertas enzImas
ayuda aL dIagnóstIco
El análisis de enzimas en el plasma sanguíneo ha desempeñado una función fundamental en el diagnóstico de varios procesos morbosos. Muchas enzimas son constituyentes funcionales de la sangre; entre algunos ejemplos están seudocolinesterasa, lipo
proteína lipasa, así como componentes de la cascada de eventos en la coagulación de la sangre y la disolución de coágulo. Otras enzimas se liberan hacia el plasma después de muerte o lesión celular; si bien estas últimas no desempeñan una función fisio lógica en el plasma, su aparición o sus concentraciones son de utilidad en el diagnóstico y el pronóstico de enfermedades y le siones que afectan tejidos específicos. Después de lesión, la con centración plasmática de una enzima liberada puede aumentar en etapas tempranas o tardías, y declinar de manera rápida o con lentitud. Las proteínas del citoplasma tienden a aparecer con ma yor rapidez que las de organelos subcelulares. La rapidez con la cual las enzimas y otras proteínas son eliminadas del plasma va ría con su susceptibilidad a proteólisis y permeabilidad a través de los glomérulos renales.
El análisis cuantitativo de la actividad de las enzimas o de otras proteínas liberadas —por lo general en plasma o suero, aun que también en orina o en diversas células— proporciona infor mación respecto al diagnóstico, el pronóstico y la respuesta al tratamiento. En el análisis de la actividad enzimática de manera característica se emplean valoraciones cinéticas estándar de ín dices de reacción inicial. El cuadro 7-2 lista varias enzimas va liosas en el diagnóstico clínico; sin embargo, estas enzimas no son absolutamente específicas para la enfermedad indicada. Por ejemplo, las concentraciones sanguíneas elevadas en fosfatasa ácida prostática a menudo se relacionan con cáncer prostático, pero también con ciertos otros cánceres y enfermedades no can cerosas. En consecuencia, los datos de la valoración enzimática deben considerarse junto con otros factores recabados por me dio de un examen clínico integral. Los factores por considerar en la interpretación de los datos sobre enzimas son: edad del paciente, sexo, antecedentes personales no patoló gicos y patoló gicos, posible consumo de fármacos o drogas, así como la sensi bilidad y la especificidad diagnóstica de la prueba enzimática.
ATP, Mg2+ ADP, Mg2+ Hexocinasa Glucosa Glucosa-6-fosfato NADP+ NADPH + H+ Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa 6-Fosfogluconolactona
fIgura 7–11 valoración enzimática acoplada para la actividad de hexocinasa. la producción de glucosa-6-fosfato mediante la
hexocinasa está acoplada a la oxidación de este producto por la glucosa-
6-fosfato deshidrogenasa en presencia de enzima añadida y NADP+.
cuando hay un exceso de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, el índice de formación de NADPH, que puede medirse a 340 nm, está regido por el índice de formación de glucosa-6-fosfato por la hexocinasa.
cuadro 7–2
principales enzimas séricas usadas en el diagnóstico clínicoenzima sérica principal uso diagnóstico
Aminotransferasas
Aspartato aminotransferasa (ASt o SGot)
Alanina aminotransferasa (Alt o SGPt)
Infarto de miocardio Hepatitis viral
Amilasa Pancreatitis aguda
ceruloplasmina Degeneración hepatolenticular
(enfermedad de Wilson)
creatina cinasa trastornos musculares e infarto
de miocardio
γ-Glutamil transferasa Diversas enfermedades hepáticas
Isozima 5 de la lactato
deshidrogenasa Enfermedades hepáticas
lipasa Pancreatitis aguda
Fosfatasa ácida carcinoma metastásico
de la próstata
Fosfatasa alcalina (isozimas) Diversos trastornos óseos,
enfermedades hepáticas obstructivas
nota: Muchas de las enzimas anteriores no son específicas para la enfermedad listada. 0 0.2 200 250 300 Longitud de onda (nm) 350 400 0.4 0.6 0.8 1.0
Densidad óptica NADH
NAD+
fIgura 7–10 espectros de absorción de naD+ y naDH. las densidades son para una solución de 44 mg/l en una célula con una
trayectoria de luz de 1 cm. El NADP+ y NADPH tienen espectros análogos