Randomization or Permutation
RANCOVA 0.0048 Wrapper t-test 0.0022 new rank-based methods Mant Heanszel 0
empleando frascos de cultivo en los que las células crecen sin agitación; estos cultivos, denominados estáticos, presentan limitaciones que conducen a la generación de gradientes de pH, nutrientes, toxinas, gases y factores de crecimiento [9]. La alternativa a los cultivos estáticos la presentan los cultivos dinámicos, en los cuales la agitación incrementa la homogeneidad del sistema y constituyen propiamente los biorreactores [9]. Los biorreactores son definidos como equipos en los cuales se desarrollan procesos biológicos o bioquímicos en un ambiente cerrado y con condiciones controladas de pH, temperatura, adición de nutrientes y remoción de residuos [11]; [144]; [145]; [9]; [10]. El biorreactor permite generar y mantener un ambiente controlado de cultivo que garantiza el crecimiento directo del tejido porque permite el desarrollo de procesos de manufactura automatizados, estandarizados, trazables, costo-efectivos y seguros en Ingeniería de Tejidos con aplicaciones clínicas [25], [146]. Se han empleado diversos tipos de biorreactores dependiendo de las características del tejido a desarrollar: spinner, tanque agitado y perfusión.
El desarrollo de tejidos y órganos durante la embriogénesis, la remodelación y el crecimiento en etapas post-natales requieren de la aplicación de fuerzas físicas: hidrodinámicas, hidrostáticas, mecánicas y eléctricas [146]. Los biorreactores tienen un
papel importante, porque proveen un ambiente controlado para el desarrollo de constructos 3D donde se puede controlar el pH, temperatura, concentración de gases disueltos, flujo de medio, esfuerzos cortantes y esfuerzos hidrodinámicos [9]; también es posible controlar el potencial redox. Sumado a lo anterior, se ha mostrado que los biorreactores son importantes al permitir la aplicación de esfuerzos mecánicos sobre los cultivos celulares que favorece el aumento en la diferenciación celular y en la deposición de la matriz extracelular [11].
Uno de los inconvenientes que se puede presentar en los cultivos en 3D es la determinación adecuada del espesor del soporte sobre el cual deben crecer las células por las limitaciones difusionales. In vivo, se ha establecido que un tejido cuyo espesor sea de 100 m no presenta limitaciones en los nutrientes que se transfieren por capilaridad; este valor se considera que es limitante y por tal motivo el diseño de biorreactores debe considerar que el transporte de nutrientes, oxígeno y factores de crecimiento debe ser homogéneo en esta escala [9]. Uno de los nutrientes que más demanda tiene es el oxígeno y se considera que la demanda de oxígeno es 25–250 mol/cm3/h basados en una
celularidad promedio de 500 millones de células/cm3 [9].
Uno de los primeros productos que emplearon biorreactores en la proliferación celular dentro de la Ingeniería Tisular fue Dermagraft®, el cual usa botellas roller y un sistema robotizado que realiza el cambio de medio; aunque el sistema fue novedoso, dificultades en el control del proceso hicieron que varios lotes fueran defectuosos [11], [26]. Recientemente la NASA evaluó el uso de un biorreactor rotatorio donde investigó la proliferación y diferenciación de células madre en células epidérmicas sobre microportadores, y encontraron la formación de estructuras epidermales en 3D [26].
El desarrollo de tejidos empleando biorreactores, es un campo estratégico que debe crecer en los próximos años a nivel mundial; Johnson et al. [40] presentan con base en encuestas a veinticuatro expertos internacionales en el campo de la Ingeniería de Tejidos, las líneas de investigación que deben impulsarse en los próximos años con miras alcanzar un mayor impacto en dicho campo. Dentro de los elementos que aparecen relevantes a nivel ingenieril están: el escalamiento de los productos obtenidos mediante ingeniería de tejidos
para atender las necesidades finales de los pacientes, la automatización de procesos, el diseño y puesta en marcha de nuevos biorreactores, la obtención de productos completamente libres de componentes animales, reducción de costos en la producción, cocultivo de dos o más tipos de células o tejidos, diseño y evaluación de nuevos materiales biodegradables con una degradación controlada, caracterización del efecto de la transferencia de masa y esfuerzos mecánicos sobre el desarrollo del tejido, entre otros. Hacia el futuro se ve la necesidad de integrar productos obtenidos usando ingeniería de tejidos en la rutina clínica, lo cual depende del desarrollo innovador de sistemas de biorreactores, de tal manera que a partir de una biopsia del propio paciente, un biorreactor permita aislar, expandir y cultivar las células hasta alcanzar el equivalente completamente autólogo dentro del ambiente clínico [11]; [147]. La generación de un tejido 3D ex vivo no solo requiere el desarrollo de nuevos modelos biológicos sino también de desafíos tecnológicos que permitan transferir los nutrientes a cultivos celulares con alta concentración celular [11].
Lafrance y Armstrong [133] afirman que el uso de un sistema de cultivo con biorreactor empleando microportadores es cerca de 120 veces más eficiente con respecto a las células producidas por unidad de volumen al aumentar la relación área/volumen; otra ventaja que presenta este sistema es el cultivo de diferentes tipos de células por separado en las condiciones apropiadas cada una de ellas. En cuanto al cultivo de células humanas, Oh et al [148] realizaron el cultivo de células madres embriónicas humanas (hESC) sobre microportadores de celulosa microgranular, recubiertos de matrigel, y encontraron un tiempo de duplicación de 21 horas frente a uno de 33 horas para el cultivo estático en cajas de cultivo, con lo que se demuestra que gracias a la agitación existe una mejor transferencia de oxígeno en el biorreactor. Palmiero et al. [149] reportan, después de 4 días de cultivo en reactor spinner, la formación de colágeno tipo I para el cultivo de fibroblastos bovinos al ser cultivados en microportadores de gelatina, comparados con el cultivo en 2D sobre frascos de cultivo. Sommar et al. [150] realizan el cultivo de fibroblastos humanos sobre microportadores de gelatina, los cuales son atrapados en geles de plasma rico en plaquetas y mediante el empleo de medios inductores logran la formación de cartílago y hueso in vitro.
HIPÓTESIS
Mediante la mezcla de plasma sanguíneo humano y alginato de sodio, es posible generar microportadores que puedan soportar el crecimiento de fibroblastos en biorreactor, lo cual permita acelerar la generación de equivalentes dérmicos con respecto a cultivos estáticos.
OBJETIVO GENERAL
Obtener un equivalente dérmico a partir del cultivo en biorreactor de fibroblastos sobre microportadores fabricados con alginato de sodio y plasma sanguíneo.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
Establecer las condiciones para la gelificación de mezclas de plasma sanguíneo y alginato de sodio.
Estandarizar un proceso de producción de microportadores a partir de mezclas de plasma sanguíneo y alginato de sodio.
Evaluar el crecimiento de fibroblastos humanos sobre los microportadores fabricados usando biorreactor.