BAB III
METODE PENELITIAN
3.1. Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorium dengan
menggunakan hewan coba berupa tikus putih betina galur Sprague dawley.
3.2. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini akan dilakukan di Fakultas Kedokteran Universitas Lampung dan
Balai Penyelidikan dan Pengujian Veteriner (BPPV) Regional III selama 4
3.3. Populasi dan Sampel
3.3.1. Populasi
Populasi adalah tikus putih betina Sprague Dawley. Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 20 tikus putih betina galur Sprague Dawley berusia 2 bulan dengan berat antara 100-200 gram yang telah diinduksi DMBA dengan dosis dan
kurun waktu tertentu. Tikus-tikus ini diperoleh dari Fakultas Peternakan Institute
Pertanian Bogor. DMBA diperoleh dari LABTIAP, Serpong.
3.3.2. Sampel
a. Kriteria Sampel Kriteria Inklusi
a. Tikus putih betina Sprague dawley
b. Sehat (gerak aktif, rambut tidak kusam dan rontok)
c. Berat badan antara 100-200 gram
d. Berusia sekitar 5-7 minggu
Kriteria Eksklusi
b. Besar Sampel
Sampel penelitian ini ditentukan menurut rumus Federer untuk uji eksperimental
rancangan acak lengkap, yaitu:
t (n-1) 15
dimana (t) adalah kelompok perlakuan, dan (n) adalah jumlah sampel
perkelompok perlakuan.
t (n - 1) 15
4(n-1) ≥ 15
4n-4 ≥ 15
4n ≥ 15+4
4n ≥ 19
n ≥ 19/4
n ≥ 4,75
n ≥ 5
Dalam penelitian ini digunakan 20 ekor tikus putih Sprague Dawley betina yang terbagi dalam 4 kelompok (masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus),
yaitu :
Kelompok I : tikus tidak diinduksi DMBA, hanya diberi akuades 1 ml per hari
Kelompok II : tikus diinduksi DMBA 20 mg/kgBB 2 kali seminggu selama 4
minggu
Kelompok III : tikus diinduksi DMBA 20 mg/kgBB 2 kali seminggu selama 4
minggu dan diberi ekstrak daun sirsak dosis 20 mg/kgBB 1 kali
sehari selama 4 minggu
Kelompok IV : tikus diinduksi DMBA 20 mg/kgBB 2 kali seminggu selama 4
minggu dan diberi ekstrak daun sirsak dosis 40 mg/kgBB 1 kali
sehari selama 4 minggu
3.4. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
3.4.1. Variabel Penelitian
a. Variabel Bebas (Independent variable)
Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.).
b. Variabel Terikat (Dependent variable)
Variabel terikat pada penelitian ini adalah gambaran histopatologi jaringan paru
3.4.2. Definisi Operasional Variabel
Untuk memudahkan penelitian dan agar penelitian tidak menjadi terlalu luas,
Tabel 1. Definisi Operasional
Variabel Definisi Skala
Dosis ekstrak
daun sirsak
Ada 4 kelompok dengan perlakuan yang berbeda :
- Kelompok I (kontrol negatif) = akuades 1 ml/hari
selama 4 minggu
- Kelompok II (kontrol positif) = induksi DMBA 20
mg/kgBB 2 kali seminggu selama 4 minggu
- Kelompok III (perlakuan coba) = induksi DMBA 20
mg/kgBB 2 kali seminggu selama 4 minggu + ekstrak
daun sirsak 20 mg/kgBB/hari selama 4 minggu
- Kelompok IV (perlakuan coba) = induksi DMBA 20
mg/kgBB 2 kali seminggu selama 4 minggu + ekstrak
daun sirsak 40 mg/kgBB/hari selama 4 minggu
Kategorik
(nominal)
Gambaran
histopatologi
paru
Melihat gambaran mikroskopis jaringan paru tikus
dengan menggunakan skala kategorik pada 5 lapang
pandang dengan skoring 0-3 untuk melihat derajat
kerusakan alveolus paru (Kirana, 2009).
0 = Tidak terjadi perubahan struktur histologis (normal)
1 = Kerusakan alveolus paru >0% - 30% (kerusakan
ringan)
2 = Kerusakan alveolus paru 31% - 60% (kerusakan
sedang)
3 = Kerusakan alveolus paru >60% (kerusakan berat)
Kategorik
3.5. Alat dan Bahan Penelitian
3.5.1. Alat Penelitian
Peralatan yang digunakan untuk ekstrak adalah alat-alat gelas, blender, rotary evaporator, dan kertas saring. Alat yang dibutuhkan dalam pemeliharaan tikus berupa kandang, tempat minum dan makan, timbangan digital, sonde lambung
berujung Nasogastric tube (NGT). Untuk pengambilan jaringan, digunakan alat-alat bedah minor. Sedangkan alat-alat untuk pembuatan serta pengamatan preparat
histopatologi adalah wadah untuk jaringan paru, object glass, cover glass, spidol, label, tissue cassette, automatic tissue processor, tissue embedding console, inkubator, mikrotom, mikroskop cahaya dan digital electronic eyepiece camera serta satu unit komputer untuk pengambilan foto preparat histopatologi.
3.5.2. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan pada ekstrak daun sirsak adalah etanol 70%. Bahan kimia
yang digunakan untuk penginduksian tikus ialah 7,12-dymethyilbenz(a)antracene (DMBA) dan minyak jagung. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan dalam
pemeriksaan mikroskopis jaringan paru adalah kertas tisu, Ketamine-xylazine,
buffered neutral formaline (BNF) 10%, xylol, alkohol, alkohol absolut, alkohol 95%, alkohol 80%, alkohol 70%, parafin, Mayer’s Hematoxyllin, lithium karbonat, eosin, larutan albumin, air hangat, larutan periodic acid 1%, schiff reagent, sodium bisulfit 10%, 1 N HCl dan akuades.
3.6. Prosedur Penelitian
3.6.1. Persiapan Hewan Percobaan
Tikus betina ditempatkan dalam kandang plastik dengan tutup terbuat dari kawat
ram dan dialasi sekam, pakan berupa pelet dan air minum diberikan ad libitum. Lingkungan kandang dibuat agar tidak lembab, ventilasi yang cukup serta
penyinaran yang cukup dimana lamanya terang 14 jam dan lama gelap 10 jam.
Sebelum melakukan percobaan tikus diadaptasi dalam kandang selama 7 hari
untuk menyeragamkan cara hidup dan makanannya. Kesehatan tikus dipantau
3.6.2. Ekstraksi Daun Sirsak Dalam Etanol 70%
Pembuatan ekstrak daun sirsak menggunakan bahan berupa daun sirsak yang telah
di keringkan sebanyak 500 gram. Kemudian daun sirsak di giling dan di ayak
dengan ayakan yang sesuai. Setelah di giling dan di ayak, daun sirsak di rendam
dalam larutan etanol 70%. Setiap hari rendaman diaduk-aduk dan disaring sampai
didapatkan maserat yang jernih. Maserat di kentalkan dengan rotary evaporator sampai diperoleh ekstrak daun sirsak.
Dosis ekstrak daun sirsak yang akan di berikan adalah 20mg/kgBB pada
kelompok III dan 40mg/kgBB pada kelompok IV setiap hari selama 4 minggu.
Berat tikus rata-rata yang digunakan adalah 200 gram, sehingga perhitungan dosis
ekstrak daun sirsak pada penelitian ini adalah :
Dosis ekstrak daun sirsak untuk kelompok III
Dosis ekstrak daun sirsak untuk kelompok IV
kemudian dari masing-masing dosis ini dilarutkan dalam 1 ml akuades untuk
diberikan secara per oral dengan menggunakan sonde lambung.
3.6.3. Pembuatan Larutan DMBA
Pelarut yang digunakan untuk senyawa DMBA adalah minyak jagung karena
DMBA larut dalam pelarut ini. Minyak jagung merupakan senyawa inert yang digunakan untuk melarutkan DMBA dan tidak memiliki sifat karsinogenik
(Singletary et al., 2007). Berdasarkan penelitian oleh Meiyanto (2007) telah ditetapkan dosis serta frekuensi DMBA yang digunakan dalam penelitian ini,
yaitu 20 mg/kg BB, dua kali seminggu selama 4 minggu. Selain itu disebutkan
pula bahwa pemberian DMBA dengan dosis 20 mg/kg BB sebanyak 10 kali dalam
4 minggu telah dapat mengakibatkan perubahan secara mikroskopis.
Berat tikus rata-rata yang digunakan adalah 200 gram, sehingga perhitungan dosis
pada penelitian ini adalah :
kemudian 4 mg DMBA ini dilarutkan dalam 1 ml minyak jagung untuk diberikan
3.6.4. Induksi Kanker Dengan DMBA, Ekstrak Daun Sirsak, dan Pengambilan Sampel
Mula-mula tikus ditimbang untuk mengetahui volume larutan DMBA dan ekstrak
daun sirsak yang akan diberikan. Bahan yang akan digunakan untuk larutan
DMBA adalah serbuk DMBA yang dilarutkan dalam minyak jagung. Induksi
menggunakan sonde oral, seminggu dua kali dengan dosis 20 mg/kgBB yang
dilarutkan dalam minyak jagung dan diberikan selama 4 minggu. Setiap tikus
pada kelompok II, III, dan IV dengan berat ± 200gr mendapatkan 1ml larutan
DMBA dengan konsentrasi 4 mg/ml.
Bahan yang akan digunakan untuk larutan ekstrak daun sirsak adalah ekstrak daun
sirsak yang dilarutkan dalam akuades. Ekstrak daun sirsak diberikan dengan dosis
20 mg/kgBB pada kelompok III dan 40 mg/kgBB pada kelompok IV, dengan
menggunakan sonde lambung. Setiap tikus dengan berat ± 200gr mendapatkan
1ml larutan ekstrak daun sirsak dengan konsentrasi 4mg/ml untuk kelompok III
dan konsentrasi 8mg/ml untuk kelompok IV.
Selama penginduksian senyawa DMBA, tikus setiap hari diinduksi ekstrak daun
sirsak. Penginduksian DMBA dan ekstrak daun sirsak dilakukan selama 4
minggu. Sonde untuk tikus kontrol dibedakan dengan tikus perlakuan untuk
mencegah adanya kontaminasi. Berat badan tikus ditimbang sebelum, selama, dan
Terminasi tikus dilakukan setelah perlakuan terakhir. Tikus diterminasi dengan
anastesi terlebih dahulu menggunakan ketamine-xylazine dosis 7100mg/kg +
5-10mg/kg secara IP, kemudian di euthanasia dengan metode cervical dislocation. Setelah itu jaringan paru tikus di ambil melalui pembedahan.
3.6.5. Pembuatan Preparat Dari Jaringan Paru Tikus
a. Fiksasi
Jaringan yang akan dibuat sediaan histopatologi difiksasi dalam larutan Buffer
Neutral Formalin (BNF) 10% minimal 48 jam hingga mengeras (matang). Sampel
organ yang terfiksasi dengan sempurna ditrimming setebal ± 0,5 cm. Potongan
kemudian dimasukan dalam tissue cassette untuk dimasukan dalam tissue processor automatic.
b. Dehidrasi
Proses dehidrasi dimaksudkan untuk menarik air dari jaringan dan mencegah
terjadinya pengerutan sampel yang diuji. Dehidrasi dilakukan dengan cara
merendam sampel dalam larutan alkohol dengan konsentrasi bertingkat (75%,
95%, dan alkohol absolut). Proses perendaman pada masing-masing konsentrasi
alkohol dilakukan selama 2 jam. Proses dehidrasi dilakukan dengan menggunakan
c. Clearing
Proses clearing atau penjernihan dilakukan 2 tahap dengan menggunakan xylol I dan xylol II. Penggunaan xylol dimaksudkan untuk melarutkan alkohol dan
parafin.
d. Infiltrasi
Infiltrasi atau impregnasi adalah proses pengisian parafin ke dalam pori-pori
jaringan. Pengisian pori-pori ini dimaksudkan untuk mengeraskan jaringan agar
mudah dipotong dengan pisau mikrotom. Parafin yang digunakan adalah parafin
histoplast.
e. Embedding dan Blocking
Embedding atau blocking adalah proses penanaman jaringan dalam blok parafin. Parafin yang digunakan parafin histoplast. Proses embedding dilakukan dengan menggunakan alat tissue embedding console.
f. Sectioning
Sectioning adalah proses pemotongan jaringan dengan menggunakan mikrotom dengan ketebalan 4 – 5 μm. Pemotongan dilakukan dengan alat rotary microtome spencer. Sediaan kemudian di letakan pada gelas objek dan disimpan dalam inkubator dengan suhu 37°C selama 24 jam.
g. Pewarnaan Hematoxyllin-Eosin
Sebelum melakukan pewarnaan, preparat histopatologi dideparafinisasi dengan
larutan xylol (I dan II) selama dua menit. Kemudian dilakukan proses rehidrasi
dengan cara mencelupkan sediaan ke dalam alkohol bertingkat (Alkohol absolut,
alkohol 95%, alkohol 80%). Perendaman dalam alkohol 95% dan 80% dilakukan
selama 1 menit. Sediaan diwarnai dengan pewarna Mayer’s Hematoxyllin dengan tahapan sebagai berikut :
a) Preparat direndam dalam larutan Mayer’s Hematoxyllin selama 8 menit; b) Dicuci dengan air mengalir (air kran) selama 30 detik;
c) Dicelupkan ke dalam larutan larutan lithium karbonat selama 15 – 30 detik;
d) Dicuci dengan air mengalir (air kran) selama 2 menit;
e) Preparat direndam dalam larutan Eosin selama 2 - 3 menit;
f) Cuci dengan air mengalir (air kran) selama 30 – 60 detik;
g) Preparat dicelupkan ke dalam larutan alkohol 95% dan alkohol absolut
sebanyak 10 kali celupan, absolut II selama dua menit, xylol I selama satu menit
dan xylol II selama dua menit.
h. Mounting
Setelah tahapan pewarnaan, sediaan ditetesi perekat permount dan ditutup dengan cover glass.
3.7. Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis secara statistik dengan uji Kruskal Wallis untuk
mengetahui perbedaan yang bermakna di antara semua kelompok perlakuan,
kemudian untuk mengetahui perbedaan di antara dua kelompok perlakuan
digunakan uji statistik Mann Whitney. Derajat kemaknaan yang digunakan α =
3.8. Diagram Alir
Gambar 6. Alur Penelitian
Aklimatisasi hewan coba di laboratorium
Klp 1 Klp 2 Klp 3
Klp K
Induksi DMBA 20mg/kgBB 2 kali seminggu (selama
4 minggu) + ekstrak daun sirsak
40mg/kgBB/hari (selama 4 minggu) Induksi DMBA
20mg/kgBB 2 kali seminggu (selama
4 minggu) + ekstrak daun sirsak
20mg/kgBB/hari (selama 4 minggu) Induksi DMBA
20mg/kgBB 2 kali seminggu (selama 4 minggu) Induksi akuades 1 ml/hari (selama 4 minggu)
Terminasi, pengambilan sampel jaringan paru tikus
Pembuatan preparat dari jaringan paru tikus, pemeriksaan mikroskopik
3.9. Etika Penelitian
