Pre-processing algorithms for Affymetrix microarrays

Aymetrix Miroarrays

Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenshaften

vorgelegt beim Fahbereih Informatik und Mathematik

der Johann Wolfgang Goethe-Universität

in Frankfurt am Main

von

Frau Dipl.-Biol. Claudia Döring

aus Frankfurt am Main

Frankfurt (2009)

Dekan: Prof. Dr. Detlef Krömker

Gutahter: Prof. Dr. Dirk Metzler

Prof. Dr. Lars Hedrih

Prof. Dr. Martin-Leo Hansmann

1 Einleitung 1

1.1 Biologishe Grundlagen . . . 4

1.2 Lymphome . . . 5

1.3 Die Miorarray-TehnologievonAymetrix . . . 7

1.4 Das Miroarray-Chip-Design von Aymetrix . . . 9

1.5 Zieldieser Arbeit . . . 11

2 Material und Methoden 15 2.1 Verwendete Genexpressionsdatensätze . . . 15

2.1.1 Datensatz vonKüppers et al. . . 15

2.1.2 Datensatz vonPialuga etal. . . 16

2.1.3 Test-Datensatz . . . 17

2.1.4 Datensatz vonBrune etal. . . 18

2.2 Ablauf eines Miroarray-Experiments . . . 18

2.3 Tehnishe Vorraussetzungen . . . 19

2.4 Explorative Datenanalyse . . . 20

2.4.1 Boxplot . . . 20

2.4.2 Histogramm . . . 20

2.4.3 Q-Q-Plot . . . 21

2.5 PräprozessierungsalgorithmenfürdieNormalisierungvon Aymetrix-Miroarray-Rohdaten . . . 21

2.5.1 Ziel der Präprozessierung. . . 21

2.5.2 Das ModellvonAymetrix . . . 23

2.5.3 ModellvonKlein etal. . . 28

2.5.4 Das VSN-ModellvonHuber etal. . . 29

2.5.8 Das sVSN-Modell . . . 40

2.6 Simulation von Daten . . . 42

2.6.1 Kontinuierlihe Verteilungen . . . 42

2.6.2 Simulieren der Daten . . . 47

2.6.3 Lineare gemishteModelle . . . 48

2.7 Cluster-Analysen . . . 51

2.8 Heatmap . . . 55

2.9 Denition der dierentiellenGenexpression . . . 55

2.9.1 Denition des Fold-Changes . . . 57

2.9.2 Das multipleTesten-Problem . . . 58

2.10 Signalweg- und Genfunktionsgruppen-Analysen . . . 59

2.10.1 Signalweg-Software und Datenbanken . . . 59

2.10.2 Überrepräsentationsanalysen mitGen-Ontologien . . . 60

2.11 Qualitätskriterienzur Beurteilung der Miroarray-Ergebnisse . . . . 63

3 Ergebnisse 65 3.1 Auswertung des Datensatzes von Küppers etal. . . 65

3.1.1 Beshreibung der statistishen Analyse-Strategie . . . 65

3.1.2 Betrahtung der dierentiell-exprimiertenGene . . . 66

3.1.3 Betrahtung der GO-Analyse . . . 71

3.2 Auswertung des Datensatzes von Pialugaet al. . . 73

3.2.1 Beshreibung der statistishen Analyse-Strategie . . . 73

3.2.2 Clusteranalyse. . . 74

3.2.3 Betrahtung der dierentiell-exprimiertenGene . . . 76

3.2.4 Betrahtung der GO-Analyse . . . 77

3.3 Zusammenfassung . . . 80

3.4 Vergleih der Normalisierungsmethodenmitsimulierter Expressions-daten . . . 81

3.4.1 Wahlder kontinuierlihen Verteilungsfunktion . . . 81

3.4.2 SimulationderDaten aufBasiseinerangepassten Gammaver-teilung . . . 94

al. . . 111

3.5.1 DeskriptiveBetrahtung der Expressionsdaten . . . 112

3.5.2 Betrahtung der dierentiell-exprimiertenGene . . . 114

3.6 Zusammenfassung . . . 117

4 Diskussion 119 4.1 Reanalyse vonpublizierten Datensätzen. . . 119

4.1.1 Reanalyse des Datensatzes vonKüppers etal. . . 119

4.1.2 Reanalyse des Datensatzvon Pialugaetal.. . . 120

4.2 Simulation von Expressionsdaten . . . 121

4.2.1 Simulation der Expressionsdaten basierend auf einer kon-tinuierlihen Verteilung. . . 121

4.2.2 Simulationder Expressionsdaten basierendauf einer ange-passten Gammaverteilung . . . 122

4.2.3 Simulation von Expressionsdaten basierend auf einem ge-mishten linearenModell . . . 122

4.3 Vergleih der vershiedenen Präprozessierungsmethoden bei einem ausgewählten Vergleih aus dem Datensatz von Brune et al. . . 123

4.3.1 Dierentielle Expression von HL im Vergleih zu normalen B-Zellen . . . 124

4.4 Ausblik . . . 124

5 Zusammenfassung 127 6 Appendix 129 6.1 R-Skript sVSN . . . 129

6.2 R-Skripte für dieSimulationvonExpressionsdaten . . . 133

6.3 Reanalyse der Miroarray-Daten vonKüppers et al. . . 149

6.4 GO-AnalysederGesamt-GenlistenahReanalysederDatenvon Küp-pers etal. . . 161

6.5 GO-Analyseder299Probesets,dienurnahReanalysederDatenvon Küppers etal. gefundenwurden . . . 162

6.6 Der Zytokine-Zytokine-Interaktionssignalweg . . . 163

and Shimodaira,2006℄ . . . 167

6.10 GO-Analyse der gesamten Genliste (599 Probesets),die nah Reana-lyse der Daten von Pialugaet al.gefundenwurde . . . 168

6.11 GO-Analyseder gesamten Genliste(363Probesets),dienurnah Re-analyse der Daten vonPialugaet al.gefunden wurden . . . 169

6.12 Ausshlieÿlih nah sVSN-Methode gefundene Probesets an einem Teildatensatz vonBrune etal. . . 169

Literatur. . . 173 Abkürzungsverzeihnis . . . 184 Danksagung . . . 185 Publikationen . . . 188 Lebenslauf . . . 191 Erklärungen . . . 193

1.1 Aymetrix Chip . . . 2

1.2 Molekulare Struktur der DNA, inklusive Transkription und Bildung der mRNA (Quelle:National Human Genome Researh Institute) . . 4

1.3 Eine B-Zellewird durheine T-Helferzelleaktiviert. (Quelle:Charles A. Janeway jr. u. a.: Immunologie. 5. Auage. Spektrum Akademi-sher Verlag GmbH, Heidelberg,Berlin 2002). . . 6

1.4 Eine B-Zelle wird nah Antigenkontakt zur Antikörper produzieren-denPlasmazelle.(Quelle:Dr.med.MarioShubert,Heidelberg, Deutsh-land) . . . 6

1.5 Allgemeines Probeset-Design für alle 3'-Expressions-Miroarrys von Aymetrix . . . 8

2.1 Ablauf eines Miorarray-Experiments . . . 19

2.2 Darstellung eines horizontalen Boxplots . . . 20

2.3 Histogramm-Beispiel . . . 21

2.4 Shematishe Darstellungder Delta-Methode . . . 31

2.5 Funktionsverlaufvonf(x) und

h

s

(

x

)

[Huberet al.,2002℄. . . 33

2.6 Shematisher Aufbaueiner mRNA . . . 39

2.7 Dihtefunktion der Weibullverteilung bei vershiedenen Form- und Skalenparametern. . . 44

2.8 DihtefunktionderLognormalverteilungbeivershiedenen

σ

und

µ

= 0

. 45 2.9 Dihtefunktion der Gammaverteilung bei vershiedenen Form- und Skalenparametern. . . 46

entsprehen den Probesets/Genen. Die absoluten Expressionswerte

sind in einer logarithmishenSkalazur Basis 2farbkodiert. . . 69

3.2 Unsupervised Clustering der 291 Probesets mit

σ

≥

1

,

5

nah Reana-lyse der Daten von Pialuga et al.. Spalten repräsentieren

indivi-duelle Patienten, Zeilen entsprehen den vershiedenen dargestellten

Genen.Die absoluten Expressionswerte sindineiner logarithmishen

SkalazurBasis2farbkodiert.DieUntersheidung derGruppenunter

dem Dendrogramm der Spaltenerfolgt durh zusätzlihen Farbode:

Rot fürPTZLs, Grün für AILTs und Blau für ALCLs.. . . 75

3.3 Heatmap der 30Probesets, dienurnah Reanalysegefunden wurden

und den gröÿten FC haben. Spalten repräsentieren die Stihprobe,

Zeilen entsprehen den Probsets/Genen. Die absoluten

Expressions-werte sind ineiner logarithmishen Skalazur Basis 2 farbkodiert. . . 78

3.4 Heatmap der 7 Gene, die nur nah Reanalyse gefunden wurden und

den gröÿten FChaben. Spaltenrepräsentieren dieStihprobe, Zeilen

entsprehen den Probsets/Genen. Die Expressionswerte sind ineiner

logarithmishen Skalazur Basis 2 farbodiert. . . 80

3.5 Histogrammder logarithmiertenrealen Expressionsdaten . . . 82

3.6 Histogramme zu den simulierten Expressionswerten und die

dazuge-hörigen Q-Q-Plots. . . 83

3.7 Histogramme zu den simulierten und gemessenen Mittelwerten und

Varianzen und den dazugehörigen Q-Q-Plots . . . 84

3.8 DieQ-Q-PlotsdersimuliertenundgemessenenExpressionswerte,

Mit-telwerteund Varianzen nahder Anpassungder empirishenVerteilung 85

3.9 Vergleih der Boxplots vonrealen und simuliertenExpressionsdaten . 86

3.10 Boxplotder Expressionsdaten miteinfaher IVT . . . 86

3.11 Vergleih der RNA-Degradation beieinfaher und doppelter

Invitro-transkription. Die einzelnen Linien repräsentieren jeweils einen

Mi-roarray-Chip.. . . 87

besets, die bei allen 10 Simulationen wiedergefunden wurden. Jedes

Feld entspriht einem anderen Quantilbereih. . . 90

3.14 Boxplots zum Wiederndender simuliertendierentiell-exprimierten

Probesets für die 10 Simulationen, d. h. die Expressionswerte sind

überalleExpressionsstärken fürdieeinzelnen Simulationendargestellt. 92

3.15 Sensitivität und Spezität der einzelnen Methoden für die 10

Simu-lationen . . . 93

3.16 SensitivitätundSpezität,dargestelltineiner ROC-Kurvebei

Simu-lation der Expressionsdaten miteiner empirishen Verteilung . . . 94

3.17 Histogramm der simulierten PM-Expressionswerte resultierend aus

einer angepassten Gammaverteilung und der QQ-Plot im Vergleih

zu den realen PM-Expressionsdaten . . . 96

3.18 Boxplotder Gamma-simuliertenExpressionsdaten . . . 97

3.19 RNA-Degradationsplot der Gammasimulierten Expressionsdaten . . 98

3.20 ProzentualerAnteilderrihtigPositivendierentiell-exprimierten

Pro-besets bei gamma-verteilten Daten. Jedes Feld entspriht einem

an-deren Quantilbereih. . . 99

3.21 Boxplotfür diePräprozessierungsmethoden für alle10Simulationen . 100

3.22 SensitivitätundSpezitätderPräprozessierungsmethodenfüralle10

Simulationen . . . 101

3.23 SensitivitätundSpezität,dargestelltineiner ROC-Kurvebei

Simu-lation der Expressionsdaten miteiner angepassten Gammaverteilung. 102

3.24 Histogramm der simulierten PM-Expressionswerte resultierend aus

einem linearengemishten Modell und der QQ-Plot im Vergleih zu

den realen PM-Expressionsdaten. . . 104

3.25 Boxplot der simuliertenExpressionsdaten basierend auf einem

li-nearen gemishten Modell . . . 105

3.26 RNA-DegradationsplotdersimuliertenExpressionsdatenresultierend

aus einemlinear gemishten Modell . . . 106

3.27 ProzentualerAnteilderrihtigpositivendierentiell-exprimierten

Pro-besets. Der Faktor gibt dieStärke der dierentiellen Expression an. . 108

3.30 Sensitivitätund Spezitätdargestellt ineiner ROC-Kurvebei

Simu-lation der Expressionsdaten miteines linear gemishten Modells . . . 111

3.31 Histogrammder logarithmiertenExpressionsdaten . . . 112

3.32 Boxplot der logarithmierten Expressionsdaten, der 12 HLs und 10

Keimzentrum-B-Zellen . . . 113

3.33 Degradationsgrad der PM-Werte in Abhängigkeit von ihrer Position

in den einzelnen Miroarrays . . . 114

6.1 GO-Analyse der Gesamt-Genlistenah der Reanalyse der Daten von

Küppers etal. . . 161

6.2 GO-Analyseder 299 Probesets dienurnahder Reanalyseder Daten

vonKüppers et al.gefunden wurden. . . 162

6.3 Signalweg Zytokine-ZytokineInteraktion . . . 163

6.4 Signalweg humaneB-Zellen Netzwerk . . . 164

6.5 Stabilitätsprüfung des Clusterverfahrens nah Suzuki et al.[Suzuki

and Shimodaira,2006℄. . . 167

6.6 GO-Analyse über die gesamte Genliste (599 Probesets) die nah der

Reanalyse der Daten von Pialugaetal. gefundenwurde . . . 168

6.7 GO-Analyse über die Genliste (363 Probesets) die nur nah der

2.1 Shematishe Darstellung der einzelnen Shritte der vershiedenen

Präprozessierungsalgorithmen bei Aymetrix-Miroarrays . . . 41

3.1 Die 299 dierentiell-exprimierten Probesets, die nur nah Reanalyse

identiziertwurden.DerShwerpunktder Regulationsstärkeliegtbei

einemFCzwishen2und3imVergleihvonHL-Linienundnormalen

B-Zellen. . . 67

3.2 Die 17 Gene, dienah Reanalyseidentiziert wurden (FDR

≤

0

.

05

), mitdemgröÿtenFCzwishen HL-LinienundnormalenB-Zellen.

Ge-ne diemit* markiertsind, wurdenimVergleihzwishenHLsund

Keimzentrums B-Zellen alssignikant-reguliertgefunden. . . 68

3.3 Die fünfGenemitdem höhstenFCzwishenHL-Linienund

norma-len,reifenB-Zellen,dienurnahReanalyseidentiziertwerden

konn-ten. Diese Gene haben eine FDR

≤

0

.

05

und wurden als signikant-dierentiell exprimiert in primären HL-Patienten gefunden ([Brune

et al.,2008℄) . . . 70

3.4 Anzahl der Gene, die dierentiell sind, und nah Durhführung der

vershiedenen Normalisierungsmethoden amDatensatzvonBrune et

al. gefundenwurden . . . 115

3.5 Ein Teil der Gene, die ausshlieÿlih mit der sVSN-Methode im

Da-tensatz vonBrune et al.als dierentiellgefunden wurden . . . 116

6.1 Genlisteder zusätzlihgefundenen 299ProbesetsnahReanalysedes

Datensatzes von Küppers etal. [Küppers et al.,2003℄ . . . 149

6.2 Genliste der zusätzlih gefundenen 30 Probesets mit

F C

≥

10

oder

≤ −

10

nahReanalysedesDatensatzesvonPialugaetal.[Pialuga et al.,2007℄ . . . 165

Einleitung

DieMiroarray-Tehnologieermöglihtheute,simultanmehrals20000Genezu

mes-sen.Seit 1994produziertdieFirmaAymetrixkommerzielleMiroarrays.Zunähst

arbeiteten nur wenige Institute und Firmen mit diesen Miroarrays. Dies lag an

den hohen Kosten und der anfangs shlehten Reproduzierbarkeit der Ergebnisse.

InzwishenistAymetrixMarktführerfürdieMiroarray Tehnologiemitvielen

ver-shiedenen Miroarrays.Vershiedene Spezies werden abgedekt. Gemessen werden

kann sowohl auf mRNA- und DNA-Ebene. 3'Expressions-Miroarrays messen auf

der mRNA-Ebene. Auÿerdem gibt es sogenannte SNP-Miroarrays (DNA-Ebene)

und mikroRNA (regulatorish wirkende RNAs) Miroarrays.

Führt man das Experiment mit selbst hergestellten DNA-Miroarrays durh, gibt

esofttehnishe Fehler.Diesewerdendurhdiestandardisierte Produktionder

Mi-roarrays und das Vorhandensein standardisierter Protokolle zur experimentellen

Aufbereitung der Gewebeproben verhindert.

MitMiroarrays können neue Gene und Signalwege gefunden werden,die füreinen

Krankheitssubtyp spezish sind. So führen Miroarrays zu einem besseren

Ver-ständnis der Pathogenese und dadurh zu einem besseren Therapiekonzept. 2006

gelanges Hummel etal. [Hummel etal., 2006℄ zum ersten Mal mitAymetrix

Mi-roarrays einGensetzuidentizieren,daseindeutigzwishendemdiusgroÿzelligen

B-Zell-Lymphom (DLBCL) und den Burkitt-Lymphom (BL) untersheiden kann.

Aymetrix-Miroarrays sind einfester Bestandteil der neuen biologishen und

me-dizinishenForshunggeworden.Zukunftsversion ist,dassMiroarrays alsStandard

in Kliniken eingesetzt werden können und so jeder Patient von dieser Tehnologie

DieserShritt verlangt neben einer standardisierten Produktion und

experimentel-lenDurhführungauheine standardisierte Dokumentation der verwendeten

statis-tishen Analysen. Hierzu gibt es viele Arbeiten, die zeigen, dass vershiedene

sta-tistishe Methoden zu vershiedenen Ergebnissen führen können [Homann et al.,

2002;Parrish and Spener,2004℄.

DerMiroarray auh Chipgenannt istdabeider Träger auf dem biologishes

Material, in unserem Fall Nukleotide (Sonden) in hoher Dihte und Anzahl (10

6

-10

7

Kopien) und ineiner denierten Anordnung aufgetragen sind (Abb.1.1).

Abbildung1.1: Aymetrix Chip

Miroarrarys basieren auf dem Prinzip der Hybridisierung. Bei der Hybridisierung

bildet unter bestimmten Bedingungen eine RNA-Kette mit dem komplementären

DNA-Strang eine stabile Doppelhelix. Die Eigenshaften des so durh

Basenpaa-rung entstandenen Hybridmoleküls führten zur Entwiklung der Methode der

Nu-kleinsäurehybridisierung.

Um die Genexpression messen zu können, muss vor der Hybridisierung die mRNA

mit uoreszierenden Farbsto markiert werden. Messbar wird die

Fluoreszensin-tensität auf Grund des linearen Zusammenhangs, dass umso mehr mRNA an den

immobilisierten Sonden bindet, desto mehr Fluoreszens wird gemessen. Die

Fluo-reszenz kann nur mit einem speziellen Sanner aus den Miroarrays gemessen

werden.DieSignalintensitätenkönnendannje nahFragestellungmitweiteren

sta-tistishen Methodenausgewertet werden.Die Signalintensitäten sindRohdaten, die

normalisiert werden müssen, um systematishe und tehnishe Fehler (z.B. bei

un-tershiedliher mRNAQualität und Quantität) zu eliminieren.

Beiallen für diese Arbeitdurhgeführten Analysen werdenvershiedene

Generatio-nen humaner Miroarrays der Firma Aymetrix verwendet. Die statistishe

Aus-wertungder numerishen Rohdaten wird mit der frei verfügbaren Statistiksoftware

R[IhakaandGentleman,1996℄unddenimBioondutorexistierendenPaketenay

[Gautieretal.,2004℄, VSN [Huber etal.,2002℄, geneplotter,multest, usw.

durhge-führt. Ende2001 wurdedas Open-Soure-and-Development-Softwareprojekt

Bion-dutoramInstitutdes DanaFarberCaner Institutder HarvardUniveritätinitiiert

[Gentlemanetal.,2004℄.R undBioondutorsollen das statistishund grash

ad-äquate Auswerten immer gröÿerer Menge genomisher Daten ermöglihen.

InsbesondereBioondutoristfester BestandteilfürdiestatistisheAuswertungvon

Miroarrays geworden.Deshalbintegriertauhkommerziellentwikelte Miorarray

-Software(GeneSpring,Spotre,Partek, Aymetrix,usw.)entwederPakete aus

Bio-ondutor oder stellt eine direkte Shnittstelle zu Rund Bioondutor bereit.

In der Literatur gibt es bereits einige Evaluationen zu den Untershieden zwishen

denvershiedenenAuswertungsalgorithmen[Irizarryetal.,2006;Ploneretal.,2005;

Choeetal.,2005;Homannetal.,2002℄.Allerdingswurdendiesenurmit

standardi-siertenDatenentwikelt,dasheiÿtunterBerüksihtigungderAngabendes

Miroar-ray-Herstellers zur Ausgangsmenge an Gesamt-mRNA. Bei manhen

Erkrankun-gensind nurwenigeTumorzellenvorhanden.Deshalb isthierdas Ausgangsmaterial

sehr begrenzt. Zum Zeitpunkt der Datenerhebung gab es noh kein kommerzielles

Protokoll, das mit so einer geringen Ausgangsmenge zu Ergebnissen geführt

hät-te. Kommerzielle Protokolle benötigen immer noh die zehnfahe Menge an Zellen

(

≥

10000),diefürdieExperimentebereitgestelltwerdenkönnen.Dadieverwendeten

Miroarrays vonAymetrixnihtfüreine solhe Vorbehandlungentwikeltwurden,

sind spezielle Anpassungen an die weiterführenden statistishen Methoden nötig,

vor allembeider Normalisierung.Zu klären ist,obund im welhem Umfangsolhe

1.1 Biologishe Grundlagen

Die DNA liegt als doppelsträngige Helix in jeder eukaryotishen Zelle vor. Das

GrundgerüstbestehtausZukerundPhosphatmolekülen,dieumzwei

Nukleotidket-tenangeordnetsind.AndiesenKettensinddievierBasenAdenin,Guanin,Thymin

undCytosinangeordnet.DiebeidenDNA-SträngewerdendurhWasserstobrüken

zusammengehalten, die von den komplementären Basen Adenin und Thymin oder

CytosinundGuaningebildetwerden.Bei derTranskription müssenzuerstdie

Was-serstobrüken aufgebrohen werden, damit die DNA teilweise in zwei einzelnen

Strängen vorliegt. Nur einer der beiden Stränge, der sogenannte odogene Strang,

wirdverwendetummitHilfederRNA-PolymerasediemRNAzu bilden.Die

Gense-quenz auf der DNA wird währendder Transkription in mRNAübersetzt und dann

durhdieTranslationandenRibosomenzufunktionell-biologishwirkenden

Protei-nensynthetisiert.DieRNA-Polymeraseverknüpftdieangelagertenkomplementären

Basen.Dabeiwirdstatt ThyminUrailindiemRNAeingebaut. Beider Basenfolge

ist,abgesehenvonUrail, diemRNAeine komplementäre Kopie eines T

eilabshnit-tes des odogenen Stranges der DNA [Wehner and Gehring,1995℄ (Abb.1.2).

Abbildung1.2: Molekulare Strukturder DNA, inklusiveTranskription und Bildung

der mRNA(Quelle: National HumanGenome Researh Institute)

mR-NAundderdarausresultierenden Proteinmenge,aberdurhMiroarrays kannman

diemRNA-Menge imVergleihzu einem anderem Experiment ermitteln. Eine

Va-lidierung der Ergebnisse eines Miroarray-Experiments auf mRNA- und auf

Pro-teinebene mit einer unabhängigen anderen Methode ist unerlässlih, um Artefakte

auszushlieÿen.DieBestätigungdurheineunabhängigeandereMethodeistgängige

Laborpraxis.

1.2 Lymphome

AllgemeinsindLymphomeShwellungenderLymphknotenoderTumoreim

Lymph-systembeigutartigemoderbösartigemGewebe.Diebösartigen(malignen)

Lympho-me werden nah der WHO-Klassizierung in Hodgkin-Lymphome (HL) und

Non-Hodgkin-Lymphome (NHL) unterteilt [Jae et al., 1998℄. Alle malignen Lymhome

stammen von malignen Lymphozyten ab. Etwa 90 % der NHLs stammen von

B-Zellenab [Fisher, 2003℄.

Zuden Lymphozyten gehören dieB-Lymphozyten (B-Zellen) und T-Lymphozyten

(T-Zellen). B-Zellen und T-Zellen werden beim Menshen im Knohenmark

gebil-det. B-Zellen sind als einzige Lymphozyten in der Lage, Antikörper herzustellen.

Sie bilden zusammen mit den T-Zellen das adaptive Immunsystem. Die T-Zellen

übernehmendieRolleder zellvermitteltenImmunantwort.WennnaiveB-Zellen,die

inunserem Blutkreislaufund imLymphsystemzirkulieren,aufeinfremdes Antigen

stoÿen,werdendieB-Zellen durhihren B-ZellRezeptor gebunden,indieZelle

auf-genommenund dann miteinem MHC-Molekül wiederan der Membran-Oberähe

präsentiert (Abb.1.3).

BeiderT-ZellenabhängigenAktivierungbedarfesnuneinergeeignetenT-Helferzelle,

die durh ihren Rezeptor die T-Zelle an den Antigen-MHC-Komplex binden kann.

Erst jetzt wird die B-Zelle durh Ausshüttung von Zytokinen der gebundenen

T-Zelleaktiviert. Ausder aktivierten naiven B-Zelle(Abb.1.4)vermehrt und

dieren-ziert sih eine antikörperproduzierende Plasmazelle (PC). Werden B-Zellen durh

körperfremde Antigene aktiviert, können sih Plasmazellen oder Gedähtnis-Zellen

entwikeln. DiesenVorgangbezeihnet manalsKlassenwehsel derB-Zelle.Die

Ver-mehrung(klonaleExpansion)ndetimKeimzentrum(GC)desLymphknotens oder

Abbildung1.3:EineB-ZellewirddurheineT-Helferzelleaktiviert.(Quelle:Charles

A. Janeway jr. u. a.: Immunologie. 5. Auage. Spektrum Akademisher Verlag

GmbH,Heidelberg, Berlin2002)

bezeihnet [Alberts etal.,1995℄.

Abbildung1.4: Eine B-ZellewirdnahAntigenkontakt zurAntikörper

produzieren-den Plasmazelle.(Quelle: Dr. med. MarioShubert, Heidelberg, Deutshland)

Sind dieAntigene oft wiederholte Polysaharide (Unterklasse der Kohlenhydrate),

wie sie z. B. bei Bakterien vorkommen, ist eine zusätzlihe Aktivierung durh eine

T-Helferzellenihtnötig.DieB-Zelleistaktiviertalleinüberihren B-Zell-Rezeptor,

diesogenannteT-Zell-unabhängigeAktivierung,ohneeinenKlassenwehsel oderdie

Bildung von Gedähtnis-B-Zellen [Alberts et al.,1995℄.

Die starke Proliferation (Zellteilung) der GC-B-Zellen erhöhen das Risiko,

(Entstehung)vonB-Zell-LymphomeneineRolle[RalfKüppers,2003℄.Währendder

Keimzentrumsreaktion nden vershiedene Umbauprozesse statt, wie z.B. die

Ein-führungvonDNA-Strangbrühen [Brossetal.,2000;Goossensetal.,1998;

Papava-siliouand Shatz, 2000℄, diesomatishe Hypermutation (Einfügen von Mutationen

in die Antikörpergene einer reifenden B-Zelle) und den Klassenwehsel. Genau in

diesenRegionen ndetman oft TranslokationenvonOnkogenen [Klein etal.,1998;

Küppers andDalla-Favera,2001℄.Auh Punktmutationenkönneneine Folgeder

so-matishen Hypermutation sein [Küppers, 2005℄.

Keimzentrums-B-Zellen zeigen harakteristish somatish mutierte V-Gene (V =

Variablitätselement der V-Gene). Dieses Merkmal ermögliht Vergleihe zwishen

B-Zell-Lymphomen und normalen B-Zellen und kann damit zur Identizierung des

Entwiklungsstadiums der Vorläuferzellendienen.

T-Zellen werden im Knohenmark gebildet, aber im Thymus ausdierenziert.

Zel-len, die fremde Antigene auf ihrer Membranoberähe repräsentieren, werden von

zytotoxishenT-Zellen(CD4

−

CD8

+

),dieeinenMHCIerkennendenT-ZellRezeptor

besitzen,erkanntundgetötet.T-Zellen,dieeinenMHCIIerkennendenT-Zell

Rezep-torbesitzen, werden allgemeinalsT-Helfer-Zellen bezeihnet. Es gibt des Weiteren

nohregulatorishe T-Zellen(Treg), T-Gedähtniszellen und NK (Natürlihe Killer

T-Zellen). Da bei der Entwiklung und Ausdierenzierung der T-Zellen weder ein

Klassenwehsel noh eine somatishe Hypermutation stattndet, ist es shwer, die

Vorläuferzellen der T-Zell-Lymphomezu denieren [Alberts et al.,1995℄.

1.3 Die Miorarray-Tehnologie von Aymetrix

DieMiroarraysvonAymetrixverwendeneineKombinationausPhotolithographie

und einer kombinatorishen hemishen Synthese, um die einzelsträngigen

DNA-Fragmente (sogenannte Oligonukleotide) auf eine Glasoberähe zu synthetisieren

[Lipshutz et al.,1999℄.

Diese Fragmente haben eine Länge von 25 Basen (auh Probe genannt). Jedes zu

messendeGenwirddurheinebestimmteAnzahlvonProbes,abhängigvon

Miroar-ray-Typ und Gen, repräsentiert. Die Anzahl shwankt zwishen 11 und 20 Probes

proGen.DiesesogenanntenPerfetMathes (PM)repräsentierendie

einesGens.DasMM hatander13.BasenpositioneinenkomplementärenAustaush

derreellenBaseundstelltdamitdienihtspezishe Bindungunddas

Hintergrund-raushen dar.

In Abbildung 1.5 ist shematish der Aufbau eines Probesets dargestellt. Die PMs

eines Probesets sind niht an nur einer Stelle auf dem Miroarray, sondern

rando-misiertaufdem Chip verteilt, um möglihe lokaleräumlihe Eekte zu minimieren.

Auh wenn nur ein Teil der PMs eines Probesets detektiert werden konnte, ist das

Signal aus den verbliebenen PMs noh zu verwenden. Jedes Probe ist mit 10

6

bis

10

7

Kopien auf dem Chip vertreten und bildet die sogenannte Probe-Cell. Das

Se-quenzdesign der einzelnen Probes auf dem Chip istso gewählt, dass Sequenzen der

mRNA nahe 3'-Ende abgebildet werden, um Probleme von teilweise degradierter

mRNAoder durhdieInvitrotranskription(Verfahrenzur Vermehrungder mRNA)

verkürzter RNAszuverringern.Am3'-EndebindetdiePolymerase,diefürdas

Invi-trotranskriptionsverfahrenbenötigtwird.JeweiterdiePolymeraseRihtung5'-Ende

wandert, umso höher ist die Wahrsheinlihkeit, dass diese ihre Funktion abbriht.

DaherkommtesvorallembeilangenTranskriptenoderbeishlehterRNA-Qualität

zu einer shlehten Abdekung der Probes Rihtung 5'-Ende.

Abbildung1.5: Allgemeines Probeset-Design füralle 3'-Expressions-Miroarrys von

Aymetrix

FürdievorliegendeArbeitwurden vershiedene Chip-GenerationenvonAymetrix

verwendet (HGU95, HGU133A, HGU133Plus2.0), die sih im Probe-Design und in

derAnzahl der Gene untersheiden. BeimSannen wird dieFluoreszenz aller Probe

Cells gemessen und im sogenannten DAT-File gespeihert. Diesen kann man mit

Ayme-trixvisualisieren. Ausden einzelnenProbe-Cells wirddieFluoreszenzstärkeineinen

numerishen Expressionswert umgewandelt und im sogenannten CEL-File

gespei-hert. Das CEL-File repräsentiert also die Rohdaten in Form einer numerishen

Matrixund kann fürweitere statistishe Analysen verwendet werden.

Aymetrix selbst hat Algorithmen entwikelt, um aus den einzelnen

Expressions-wertenderProbes einenaggregiertenWert fürdas Probeset oderGen zuberehnen.

Allerdings wurde dieses Verfahren shon mehrfah in der Literatur kritisiert. Dort

wurdebelegt, dass diese Methode einigeShwähen aufweist [Irizarry etal., 2003b;

Lazaridisetal.,2002℄.Esgibteine Vielzahlkommerziellerund freierhältliher

Soft-ware zur statistishen Analyse von Miroarray-Daten. R ist die freie Software mit

einer Sammlung von Softwarepaketen mit neu implementierten Algorithmen. Alle

statistishenAnalysen dieserArbeitwurdenmitRund Bioondutordurhgeführt.

Bioondutor ist ein frei erhältlihes Softwareprojekt, aufbauend auf R zur

Erstel-lung von Werkzeugen, zur Analyse und zur Interpretation genetisher Daten.

DasvierstugeVerfahren(Hintergrundkorrektur,Normalisierung,PM-Adjustierung,

PM-Signal Zusammenfassung), gehört zum ay-Paket von Bioondutor. Es wird

imMaterial- und Methodenteil detailliertbeshrieben und aggregiert aus den

Pro-be-Signalendes CEL-Fileseinen Expressionswert pro Probeset oder Gen.

1.4 Das Miroarray-Chip-Design von Aymetrix

Gegeben ist ein Projekt mit n Chips, wobei jeweils ein Chip eine Gewebeprobe

repräsentiert. Für jeden Chip

i

= 1

, . . . , n

sind m Gene vorhanden, die durh

l

j

(

j

= 1

, . . . , m

)

Probe-Pairs vertreten sind. Jedes Probe Pair besteht aus einem

PM und einem MM (Siehe Abb.1.5). Gegeben ist also

P M

ijk

, wobei

i

= 1

, . . . , n

der Chip,

j

= 1

, . . . , m

das Gen und

k

= 1

, . . . , l

j

das Probe ist. Abhängig vom Chiptyp und dem jeweiligen Gen kann dieAnzahl von

l

j

dierieren. Somitergeben sih

n

·

P

m

j

=1

l

j

Werte für diePM-Werte, äquivalenterhält man dieMM-Werte mit

MM

ijk

.

Übersiht der Analyse im Bioondutor

Zunähst wird eine Hintergrundkorrektur vorgenommen. Dies ist nötig, da auh

Bio-ondutor stellt im ay-Paket drei vershiedene Möglihkeiten zur Auswahl. Da in

der Normalisierungmethode VSN von Huber et al. dieser Shritt shon enthalten

ist,wird aufdiese Korrekturverzihtet. Aufgrund untershiedliher mRNA-Mengen

kann eszu vershiedenen Fluoreszenzintensitätenkommen.Im zweitenShritt wird

deshalb eine Normalisierung durhgeführt. Bioondutor bietet dazu eine Vielzahl

Möglihkeiten. Alle Reanalysen wurden mit der Normalisierungsmethode VSN von

Huber et al.normalisiert. Im Material- und Methodenteil wird hierauf detaillierter

eingegangen.Bei diesem Shritt erhält man die normalisiertenWerte

P M

norm

ijk

und

MM

norm

ijk

. Für den nähsten Shritt, die PM-Adjustierung, wird auf die

MM

norm

ijk

verzihtet, das heiÿt hier ndet keine Verrehnung der

P M

norm

ijk

mit den

MM

norm

ijk

statt.DiesesVorgehenshlagenBolstadetal.[Bolstad etal.,2003℄ vor.

Berüksih-tigtwird damit,dass dieMM Signaleoft niht wie vonAymetrix angenommen

unspezishe Bindungen darstellen [Naef et al., 2002℄. Der Wert für das

Probe-Pair-k wird durh

P M

norm

ijk

repräsentiert. Die

n

·

P

m

j

=1

l

j

Werte haben sih in diesem Shritt halbiert. Wie wird nun aus

l

j

Wertendes Gens

j

einWertfürdieExpressiondiesesGens

j

berehnet? Bioondu-tor stellt einige Möglihkeiten zur Verfügung. Dieser abshlieÿende Shritt bei den

Reanalysenwirdmitder Methode vonTukeyet al.[Tukey, 1977℄ durhgeführt.Der

Material-undMethodenteilenthält eine detaillierteBeshreibung dieserMethoden.

Die verrehneten

P M

norm

ijk

, oder allgemeiner

y

ijk

, für jeden Chip

i

und jedes Gen

j

werden imWeiteren mit

x

ij

bezeihnet und bildenzusammen dieMatrix

X

.

X

=















x

11

x

12

· · ·

x

1

n

x

21

x

22

· · ·

x

2

n

. . . . . . . . . . . .

x

m

1

x

m

2

· · ·

x

mn















DieseMatrixist dieessentielle Grundlagefür allestatistishen Analysen. Abhängig

von der Fragestellung gibt es vershiedene weitere statistishe Analysen-Methoden.

Eine wihtige Fragestellung ist z. B., welhe Gene dierentiell zwishen zwei

de-niertenGruppen exprimiertsind und in welhem Ausmaÿ.

Das Ausmaÿ, also die Stärke der dierentiellen Expression wird auh Fold Change

(FC)genannt.WerdendieGruppenimVorfelddeniert,sprihtmanauhvon

über-wahten (supervised) Analysen.Sowohl dieSignikanz eines Gens alsauh der FC

ha-ben, werden alsbiologishrelevantangesehen (z. B. FCmindestens2- oder 3-fah).

So können z. B. Subtypen einer Erkrankung, z. B. mit Hilfe von Clusteranalysen

entdektwerden.BeidiesenClustermethodenwirdimAllgemeinennihtüberwaht

(unsupervised) vorgegangen, das heiÿt die Gruppen werden niht vorher deniert.

Auh gibt es Methoden, die erlauben, einen Prädiktor zu erstellen, der

zukünfti-ge Patientengruppen eindeutig einer bestimmten Klasse zuordnet. Immer mehr an

Bedeutung gewinnt die Fragestellung nah involvierten Signalwegen und

Genfunk-tionsgruppen. Dabeiwird niht mehrauf der Einzel-Gen-Ebeneanalysiert, sondern

in zu einem Signalweg gehörenden Gengruppen oder einer Funktionsgruppe. Von

besonderembiologishenInteressesind Gengruppenoder Signalwege,dieeine

Über-repräsentierung oder Unterrepräsentierung zeigen.

1.5 Ziel dieser Arbeit

Dievorliegende Arbeit istin zweiTeile untergliedert:

1. Die Vorteile neuer statistisher Methoden bei der Miorarray Auswertung an

shon veröentlihten Datensätzen werden dargestellt:

•

Am Beispiel der Analyse von Klein et al. [Klein et al., 2001℄ werden Ansätze zur Verbesserung der Methode aufgezeigt.

•

Ergebnisse derReanalyse sindzusätzlihe Gene,dienurnahder Reana-lyse gefunden werden.

•

diebiologishe Relevanz der zusätzlihgefundenen Gene.

2. Expressionsdaten, die aus geringen mRNA-Mengen stammen, werden

statis-tish analysiert:

•

Präprozessierungs-Algorithmen werden ansimuliertenRohdaten geprüft und bewertet.

•

Welhe Methoden zeigen welhe Vorteile?

•

ZeigtdieGewihtungder Probes inAbhängigkeitihrerPositionimT ran-skript die Vorteile der Analyse?

•

Reanalyse eines Vergleihes mit allen angewendeten Präprozessierungs-Algorithmen.

FürdieReanalyse wurden dieDatensätze vonKüppers etal.[Küppers etal.,2003℄

und Pialugaet al. [Pialuga et al., 2007℄ verwendet. Dr.Ulf Klein hat beide

Da-tensätze mitderselben Methode statistish analysiert.

Wie shon im Vorfeld erwähnt, gibt es bestimmte Erkrankungen, bei denen das

Ausgangsmaterial nur begrenzt zur Verfügung steht. Mit dem in unserem Institut

entwikeltemProtokollisteserstmalsmöglih,ausnur1000ZellengenügendmRNA

zuamplizieren,umeinMiorarray-Experimentdurhführenzukönnen.Dader

ver-wendeteMiroarray für dieseArt ampliziertermRNA niht konzipiertist,kommt

eszu systematishenFehlern.DerAnteilanfalshnegativenWerten isthoh.Inder

vorliegendenArbeitwirdnahderNormalisierungnoheineGewihtungder Probes

vorgenommen. Diese Methode berüksihtigt wesentlihe Teile des systematishen

Fehlers,der währendder mRNA-Prozessierung entsteht.

Zwar haben Cope et al. [Cope et al., 2006℄ gewihtete Probes in ihren

Algorith-musRMA(Robust MultihipAverage)implementiert,konntenaberkeinedeutlihen

Untershiede und Verbesserungen zum Standard RMA-Algorithmusfeststellen.Die

verwendete Normalisierungsmethode VSN von Huber etal. zeigte eine höhere

Spe-zität und Sensitivität bei der dierentiellen Expression. Damit war ein anderes

ErgebnisalsbeiCope etal.zu erwarten.

ZuerstwurdensimulierteDatenverwendet,umdievershiedenen

Präprozessierungs-algorithmenvergleihenzukönnen.AneinemdafürkonzipiertenTestdatensatz

wur-den dievershiedenen Methoden verglihen. Dazu wurden zwei vershiedene

Grup-penvonAusgangsgewebegewählt,dieeinhohesMaÿandierentiellerExpression

er-wartenlieÿen.AnhandvonQualitätskriteriensolltegeklärtwerden, obdie

vershie-denenMethoden einenEekt aufdieweitere statistishe Analyse haben.

Qualitäts-kriteriensinddabeiSensitivitätundSpezität,Anzahlderdierentiell-expremierten

Gene und der Einuss auf resultierende Gengruppen (z. B. Gen-Ontologien und

Signalweg-Analysen).LetztendlihsolltendievershiedenenMethodenaneinem

rea-lenTeildatensatzvonBrune etal.[Brune et al.,2008℄angewendet und miteinander

verglihen werden.

Im zweiten Kapitel werden die verwendeten Datensätze bezüglih ihrer

mRNA-Prozessierung,der verwendeten Materialienund Gewebebeshrieben. ImAnshluss

Daten-sätzeangewendet wurden. Esfolgteine Beshreibung der gewihtetenProbes durh

ein angepasstes lineares Modell. Im Ergebnisteil wird deren potentieller Vorteil

er-örtert.

Im dritten Kapitel werden zunähst die Ergebnisse der Reanalyse der beiden

Da-tensätze dargestellt. Anshlieÿendgeht es um dieSimulationvon Expressionsdaten

mit vershiedenen Modellen und die Anwendung der vershiedenen Methoden, die

zuletzt auf einen Teildatensatz angewendet und verglihen werden. Das Verhalten

im biologishen Kontext wird besonders herausgearbeitet und wenn möglih

eine Empfehlungzur weiteren statistishen Analyse gegeben.

Material und Methoden

2.1 Verwendete Genexpressionsdatensätze

2.1.1 Datensatz von Küppers et al.

Küppers etal.[Küppers etal.,2003℄haben dieerstegenomweite

Genexpressionsan-layse mit Aymetrix-Miroarrays an Hodgkin-Lymphom-Zelllinien (HL-Zelllinien)

imVergleih zu normalen B-Zellen durhgeführt. Bei den HL-Zelllinien, handelt es

sihum kontrollierte,etablierte und kultivierteZellliniendievonPatienten mitHL

stammen.

Thomas Hodgkin beshrieb 1832 zum ersten Mal das HL [Hodgkin, 1832℄. Fast 70

JahrespäterwurdeesvonSternberg [Sternberg,1898℄und Reed[Reed,1902℄weiter

harakterisiert. In der westlihen Weltist das HL mit 2- 4 Fällenpro 100.000eine

selteneErkrankung, abermit einemAnteilvon30% eines der häugsten malignen

ErkrankungendeslymphatishenSystems.DasHLlässtsihinzweiIdentitäten

un-terteilen:dasklassishe HL(HL)unddasnodulärelymphozyten-prädominanteHL

(NLPHL).95%aller HLssindder IdentitätHLzuzuordnen. Die Besonderheit,die

beideIdentitätenharakterisiert,sinddiewenigengroÿenneoplastishen

(neubilden-den)Zellen,diesihineinemzellulärenInltratnihtneoplastisherZellenbenden

[Jaeetal.,1998℄. Bei HLspriht man dannvonHRS-Zellen und beiNLPHL von

L&H-Zellen.Wenigerals1%des inltriertenGewebesmahendieHRS-Zellenoder

L&H-Zellenaus[Hansmannetal.,1999;Weissetal.,1999℄.Allerdingsuntersheiden

sihbeide Identitätendes HLsu.a.imImmunphänotyp,inder Epidemiologieund

Das HL wird vor allem in vier Subtypen unterteilt: nodulär sklerotisierend (NS;

60 - 80 % der HL), mishzellig (MC; 15 - 30 % der HL), lymphozytenarm (LD;

1%der HL) und lymphozytenreih (IrHL;6 %der HL) [Harris,1999℄. Moderne

Therapiekonzepte haben zu einem sehr guten Therapie- und Heilungserfolg beim

HLgeführt unabhängigvomSubtyp. Eine genetishe Disposition liegt nahe, daein

gehäuftesAuftretendesHLsineinigenFamilienundein99-fahhöheresRisikoeiner

ErkrankungbeieineiigenZwillingenvermutet wird [Gruerman and Delzell, 1984℄.

Epidemiologishen Studien zeigten eine Abhängigkeit des Erkrankungsrisikos von

Geshleht, sozialem Lebenssituation und ethnishen Hintergrund [Gutensohn and

Cole,1980℄.

DieHL-ZellliniendientenbeiKüppersetal.alsrepräsentativesModellzumprimären

HLdeslymphatishenGewebes. DieHL-ZelllinienL428undHDLM2stammenvon

PatientenmitHLmitdem SubtypNSund dieHL-ZelllinienKMH2undL1236vom

Subtyp MC. Die HDLM2 stammen von T-Zellen, die anderen drei stammen von

B-Zellenab. Allenormalen B-Zellender vershiedenen Subtypen (GC-B-Zellen,

Ge-dähtnis B-Zellen,NaiveB-Zellen und PC-Zellen) wurden aus menshlihen T

onsil-len(Mandeln) gewonnen.

Der Datensatz von Küppers et al. wurde mit dem Aymetrix Miroarray Typ

HGU95A erstellt. Auf diesem Miroarray benden sih 12626 Probesets.

Verwen-detwurdedas Standard-AymetrixProtokoll(Einsatzmengeungefähr

1

·

10

6

Zellen

pro Miroarray).

2.1.2 Datensatz von Pialuga et al.

Der zweite reanalysierte Datensatz ist von Pialuga et al. [Pialuga et al., 2007℄.

IndieserArbeitwurdeeine bestimmteGruppevonT-Zell-LymphomenimVergleih

zunormalenT-Zellenuntersuht.BeidenT-Zell-Lymphomenhandeltessihum

so-genannte periphere T-Zell-LymphomeTyp unspezish (PTZL/U). In diese

Grup-pefallenalleT-Zell-Lymphome,dienihtweiter harakterisiertwerden können.Die

PTZL/U-LymphomesinddieammeistenverbreitetenT-Zell-Lymphomeundzeigen

morphologishund phänotypisheine sehrgroÿeHeterogenität.Auÿerdemsprehen

diese Lymphome nur shwah auf die Therapie an und haben eine shlehte

Pro-gnose. 60 - 70 % der PTZLs fallen in die Gruppe der PTZL/U und können niht

mit der Morphologie, mit dem Phänotyp oder durh molekulare Untersuhungen

ag-gressivsteNHL. Insgesamt wurden 28PTZL/U und 20normleT-Zell-Populationen

(bestehend aus CD4 und CD8) verwendet. Auÿerdem wurden zusätzlih zwei

wei-tere Subtypen des T-Zell-Lymphomsmit jeweils 6 Miroarays verwendet (AITL =

angioimmunoblastishesT-Zell-Lymphom,ALCL=anaplastishesgroÿzelliges

Non-Hodgkin-Lymphom).DienormalenT-Zell-Populationenstammenentwederausdem

Blutoder aus Tonsillen gesunder Spender.

FürdieseStudiewurdederHGU133Plus2.0Miroarray-TypvonAymetrix

verwen-det.Dieserhat 54676 Probesets auf demMiroarray, wasungefähr20000 einzelnen

Genenentspriht. Verwendet wurde das Standardprotokollvon Aymetrix.

Pialugaetal.haben sogenannte Ganzshnitte fürdieeinzelnen Tumorprole

ver-wendet.HierwurdeeinganzerQuershnitt einesTumorarealsgewählt,derzum Teil

groÿeMengenanKontaminationenenthält.MitKontaminationsind hieralleZellen

gemeint,die nihtTumorzellensind.

2.1.3 Test-Datensatz

Bevor der Datensatz von Brune et al. [Brune et al., 2008℄ generiert wurde,

muss-te eine geeignete Methode etabliert werden, um aus dem zur Verfügung stehenden

MaterialüberhauptGenexpressionsanalysenmitMiroarrays vonAymetrix

durh-führen zu können.

Die Zellen des HLs wurden einzeln per Lasermikrodissektion aus dem

Gewebe-shnittisoliert. Deshalb konntenureine Mengevonmaximal 1000 Zellen pro

Pati-entisoliertwerden.DieLaser-MikrodissektionunddiePressure-Catapulting-Tehnik

(LMPC) mit UV-Laser der Firma P.A.L.M. mahten es erstmals möglih, einzelne

Zellen so aus dem Gewebe zu isolieren, dass die DNA- und RNA-Qualität

ausrei-hend gut war, um weitere Experimente durhzuführen. Zum Zeitpunkt der

Date-nerhebung gab es nur das Standardprotokoll von Aymetrix und anderen Firmen,

derenProtokolleaber mindestens

1

·

10

6

Zellen benötigen.

Um trotzdem Genexpressionsanalysen an nur 1 000 Zellen durhführen zu können,

musste eine neue mRNA-Isolierungs- und mRNA-Amplikationsmethode gefunden

werden. Nahdem eine geeignete Methode gefunden wurde [Brune etal., 2008℄

tes-tete man zunähst an einem kleinen Datensatz die Qualität des neuen Protokolls.

Hierfür wurden eine HL-Zelllinie und ein Burkitt-Lymphom-Probe verwendet. Da

inFolgedes neuenProtokollszweiVermehrungsshritte (Invitrotranskription)der

maskiertsind. Das Probe-Design von Aymetrix istauf dem verwendeten

Miroar-ray HGU133Plus2.0 niht für solhe vorbehandelten Zellproben vorgesehen. Zwar

konnten dieDaten erfolgreihmitder VSN-Methode vonHuberetal.[Huberetal.,

2002,2003℄analysiertundpubliziert[Bruneetal.,2008℄werden,dieFragenaheiner

geeigneten Anpassung der Daten an das Miroarray-Design blieb allerdings oen.

DerTestdatensatz eignetsih,um eine Methode zu entwikeln, diedas Miroarray

-Designmiteinieÿenlässt. Duplikateeiner HL-Zelllinieund einesBL-Falleswurden

mitdem neuen Protokollund dem Standardprotokoll vonAymetrix durhgeführt,

um beide zu vergleihen.

2.1.4 Datensatz von Brune et al.

Der Datensatz von Brune et al. [Brune et al., 2008℄ wurde mit etablierten

statis-tishen Verfahren ausgewertet, allerdings ohne auf das Miroarray-Design und die

zusätzlihe Problematikmitder geringen Ausgangsmengean mRNAeinzugehen.

Der Datensatz von Brune et al. enthält zwei Gruppen: Zum einen die

mikrodissi-zierten Lymphomzellen, die entweder in Zellgruppen oder als Einzelzellen isoliert

wurden,zumanderen durhFluoreszenz-aktivierterZellseperation(FACS) sortierte

normaleB-Zellen aus der Tonsillevongesunden Spendern. Inder ArbeitvonBrune

et al.wurden Gene identiziert, die bei der Pathogenese des NLPHL eine wihtige

Rollespielen.ZumVergleihwurden dieniht-malignenUrsprungszellen,die

GC-B-Zellen,verwendet.DerVergleihvonHLundGC-B-Zellenwirdindervorliegenden

Arbeitreanalysiert und mit den Standardverfahren verglihen.

2.2 Ablauf eines Miroarray-Experiments

InAbbildung2.1istshematishdargestellt,wieeinGenexpressionsprolausZellen

erstellt wird. Im ersten Shritt wird aus einem Zellpool aus Tumorgewebe oder

einer Zellkulturdie mRNA extrahiert. Diese wird im zweiten Shritt vermehrt und

in unserem Fall, mit Fluoreszenz markiert. Im dritten Shritt wird die markierte

mRNA auf dem Miroarray-Chip hybridisiert. Im letzten vierten Shritt wird die

FluoreszenzmitdemAymetrix-Sannergemessen.GenauereInformationenenthält

Abbildung2.1: Ablaufeines Miorarray-Experiments

2.3 Tehnishe Vorraussetzungen

Die statistishe Auswertung wurde mit der frei verfügbaren Statistiksoftware R,

Versionen 2.1und 2.8, durhgeführt [Ihakaand Gentleman,1996; Gentleman etal.,

2004℄.Auÿerdem wurden vielePakete aus dem Bioondutor-Projektbenutzt(ay,

vsn,geneplotter,mathprobes usw. [Gautieretal.,2004; Huberetal., 2002;

Gentle-manetal.,2004; Huberand Gentleman,2004℄).Bioondutorist fester Bestandteil

inder Analyse vershiedener, hohdimensionalergenomisher Daten geworden.Das

liegt an der groÿen Anzahl implementierter Algorithmen und der Tatsahe, dass

die Software frei verfügbar ist und von herausragenden Wissenshaftlern gepegt,

und durh neue Pakete erweitert wird. Die Software ist niht nurim akademishen

Bereihverbreitet, sondern bietet auh fürkommerzielle Software Shnittstellen zu

Bioondutor. FürdieDatenanalyse wurden einRehner mitIntelArhitektur(3,2

GHzCPU) und 4GBRAM mitBetriebssystem Windows XPund einLinux-Server

mit16GBRAMverwendet.VorallemderVSN-AlgorithmusvonHuberetal.[Huber

2.4 Explorative Datenanalyse

2.4.1 Boxplot

Zurgrashen Visualisierungeines Sets von n Miroarrays kann manBoxplots

ver-wenden. Durh die grashe Dartsellung bekommt man eine gute Übersiht über

dieVerteilungder Signalintensitäten der einzelnen Chips. Wihtige Streuungs- und

Lagemaÿe(Median,diezweiQuartileundExtremwerte)zeigtenshnell,inwelhem

Bereihdie Daten liegen und wie dieDaten überdiesen Bereih verteilt sind.

Die Box beinhaltet die mittleren 50 % der Daten. Sie wird durh das obere und

untereQuartilbegrenzt.Die Ausdehnung der Boxrepräsentiert die

Interquartilran-ge (IQR). Sie ist ein Maÿ für die Streuuung der Daten und wird aus der Dierenz

des oberen und unteren Quartilsberehnet. Whiskers sind die Datenpunkte

auÿer-halb der Box. Die Länge der Whiskers sind niht unbedingt festgelegt.John Tukey

[Tukey, 1977℄ legte fest, dass die Whiskers maximal die 1,5 fahe der IQR haben.

Allerdingsendet derWhisker niht genauandiesem Punkt,sondern andem jeweils

äuÿersten Datenwert, der noh innerhalb dieser Grenze liegt. Die Daten auÿerhalb

der Whiskers werden alsAusreiÿer deniert (Abb.2.2).

Abbildung 2.2: Darstellungeines horizontalenBoxplots

2.4.2 Histogramm

Ein Histogrammkann einen guten Überblik über die Verteilung der Daten geben

(Abb.2.3). Zu bedenken ist allerdings, dass das Aussehen von Histogrammen oft

starkvon der Klassenanzahlund beiwenigen Klassenauhvonder Platzierung der

Histogramm

Werte logarithmiert

Häufigkeiten

4

6

8

10

12

14

0e+00

1e+05

2e+05

3e+05

4e+05

Abbildung2.3: Histogramm-Beispiel 2.4.3 Q-Q-Plot

Der Quantil-Quantil-Plot (Q-Q-Plot)stellt dieQuantilezweier statistishen V

aria-blengrashgegenüber. DabeiwerdendieBeobahtungsmerkmalezweierMerkmale

der Gröÿe nah sortiert, als Wertepaare zusammengefasst und grash in einem

Koordinatensystem dargestellt. Ergeben die Punkte annähernd eine Gerade

y

=

x

kannman davonausgehen,dass beideMerkmalegleihverteiltsind. BeimVergleih

mit den Quantilen der Standard-Normalverteilung gilt zusätzlih, dass die Gerade

y

=

a

+

bx

der Normalverteilungmit

(

µ, σ

2

₎

entspriht.

2.5 Präprozessierungsalgori t hmen für die

Normali-sierung von Aymetrix-Miroarray-Rohdaten

2.5.1 Ziel der Präprozessierung

Aufgabenstellung:

AusdenBilddatenvonAymetrixsollenmitgeeignetenVerfahrenExpressionswerte

fürdieProbesets ermitteltwerden.Typisherweise lässtsihdiePräprozessierungin

vierShritteunterteilen,diesihjenahangewandterMethode starkuntersheiden.

Zunähstwirderläutert,auswelhemGrunddieeinzelnenPräprozessierungsshritte

1. Die Hintergrundkorrektur:

EinHintergrundsignalkanndurhEigenuoreszenzderReagenzien,Streuliht

oder sonstigetehnisher Problemeentstehen. Selbstnahdem Sannen eines

Arrays ohneRNA (z. B. mitdestilliertemWasser) wird man ein

Fluoreszenz-signalmessen können.Zielder Hintergrundkorrektur ist,dieStärke dieses

ar-tiziellenSignalszu shätzen und vonden gemessenen Werten zu eliminieren.

Ist dieses Verfahren erfolgreih, sollte ohne RNA auf dem Miroarray keine

Fluoreszenzsignalmehr meÿbarsein [Gautier etal.,2004℄.

2. Normalisierung:

Unabhängigdavon,welhedervielenvershiedenenNormalisierungsmethoden

verwendetwird,allehabendas Ziel,dien-ArrayseinesExperiments

vergleih-bar zu mahen. Besteht ein Experiment aus mehreren Arrays, so ist die

Va-riabilitätder Messwerte sehrgroÿ. Dabeimuss man zwishen der biologishen

(Untershied zwishen Tumorzellenundnormalen Zellen)undder tehnishen

Variabilität(BenutzungvoneinemodervershiedenenProtokollen)

untershei-den. Die biologishe Variabilität ist die für den Wissenshaftler interessante.

Dietehnishe Variabilitätisthiereher störendundkann dazuführendie

bio-logishe Variabilitätzu verändern. Ziel istdeshalb, durh die Normalisierung

dietehnishe Variabilitätzu minimieren.DieUrsahen fürdietehnishe

Va-riabilitätkönnen vielfältigsein. Einussreihste Quelle ist wahrsheinlih die

Durhführung des Experiments, aber auh die Herstellung der Miroarrays

und der Laborreagenziensind eine Fehlerquelle. Shon geringfügige

Änderun-gen des Protokolls (z. B. Ausgangsmenge mRNA) können dabei zu massiven

Untershieden des Fluoreszenzsignalsführen.

Mit Hilfe von Boxplots, QQ-Plots und Histogrammen kann man wesentlihe

Untershiede der vershiedenen Experimente erkennen. Ohne Normalisierung

käme eshier zu dierentiell exprimierten Genen.

Die Normalisierungsverfahren lassen sih in zwei Gruppen aufteilen. Es gibt

Verfahren, die einen Miroarray als Basis verwenden, mit dessen Werten die

anderen n - 1 Arrays normalisiert werden. Andere Methoden benötigen für

die Normalisierung alle Arrays. Es gibt bis heute keinen Goldstandard für

dieNormalisierungmethode. Allerdingsgeben Boes und Neuhäuser [Boesand

Neuhäuser, 2005℄ einen guten Überblik über vershiedene

3. Probe-spezishe Hintergrundkorrektur:

Nah der Normalisierung ist zu entsheiden, ob und wie die PM-Werte und

MM-Wertemiteinanderverrehnetwerden.ZielderPM-Adjustierungist,einen

Wert für das Probe Pair zu berrehnen. Bolstad et al. [Bolstad et al., 2003℄

haben alsErste vorgeshlagen,nurdiePM-Werte für diePM-Adjustierung zu

verwenden.

4. Aggregationsmethoden:

Nahder PM-Adjustierung hatmaneinenWert

y

ijk

fürjedes Probeset bereh-net,dabei ist

i

der Miroarray,

j

das Gen und

k

das Probe.Zielder Aggrega-tionsmethode ist es, aus den Einzelwerten eines Probesets einen Wert

x

ij

zu berehnen.

Die detaillierte Beshreibung der in dieser Arbeit verwendeten Modelle folgt

die-sem Kapitel. Es gibt auÿer den genannten eine Vielzahl weiterer Modelle für die

Präprozessierung.

2.5.2 Das Modell von Aymetrix

Aymetrix[Aymetrix, 2002℄ hat einen eigenenAlgorithmusentwikeltund diesen

ineine Software Namens Miroarray Suite (MAS)implementiert.Mit diesem

Algo-rithmus werden die vier Shritte der Präprozessierung durhgeführt. Die MAS gab

eszunähstindenVersionen4.0und5.0.BeiVersion4.0warennegativeSignalwerte

möglih.Dasistaus biologisherSiht nihtsinnvollund fürweitereAnalysen istes

problematish,mitnegativen Werten umzugehen. Bei Version 5.0wurde dies

geän-dert. Heute istdie Software von Aymetrix (Expression Console 1.1= EC1.1) frei

verfügbar und neben dem MAS 5.0-Algorithmus sind weitere Algorithmen (unter

anderem RMA) implementiert.

MAS-4.0-Algorithmus

DieMethode zurBerehnungder ExpressionbeiMAS4.0wirdauhAverage

Die-rene genannt.Diese mittlerweileveralteteMethode wurdebeidem Datensatzvon

Küppers et al. [Küppers et al.,2003℄ verwendet. Deshalb hier eine kurze

Beshrei-bung:

DurhshnittderDierenzenderPM-WerteundderdazugehörigenMM-Werteeines

Probeset ist.ZielvonAymetrixfürdieProbe-spezisheHintergrundkorrekturwar

das Einstellen von PM-MM. Bis November 2002 war dieser Algorithmus Standard

beiAymetrix.Umeinen robusten Durhshnittswert fürdieeinzelnen ProbePairs

zugewährleisten,werdenzunähstmehrere Werte ausder Durhshnittsberehnung

herrausgenommen.

Minimalen und Maximalen Wert der

y

ijk

über alle Probe Pairs

k

eines Gens

j

im

i

-tenMiroarray werden imerstenShritt zunähst ignoriert,daessihum

Ausrei-ÿer handeln könnte. Aus den verbleibenden Werten werden der Mittelwert

y

ij

und

dieStandardabweihung

s

(

y

ij

)

berehnet. Im letzten Shritt werden alleWerte

y

ijk

gelösht,diemehr alsdrei StandardabweihungenvomMittelwertzeigen. Wenn die

gelöshtenWertenihtmehralsdreiStandardabweihungenvomMittelwertentfernt

abweihen,können siedabei wiederberüksihtigtwerden. DieMenge

A

ij

wird also aus den verbliebenden Werten der Probe-Pairs gebildet. Dieses wird als

Average-Dierene,oder kurz AvgDi,bezeihnetund lässtsihfürjedesGen

j

einesChips

i

folgendermaÿen berehnen:

AvgDif f

ij

=

1

N

(

A

ij

)

X

k

∈

A

ij

y

ijk

(2.1)

Dabei ist

N

(

A

ij

)

die Anzahl der Werte inder Menge

A

ij

.

FürdieAnalysemitMAS5.0werdenzunähstdieWertederProbe-CellseinesChips

benötigt.AlsNähsteswirdeineHintergrundkorrekturdurhgeführt.Fürdie

Hinter-grundkorrektur wird der Miroarray in K gleih groÿe Segmente

Z

k

(

k

= 1

, . . . , K,

Voreinstellung K=16) unterteilt. Kontroll-Probe-Cells und maskierte Probe Cells

bleiben bei der Kalkulation unberüksihtigt. Die Probe-Cell Intensitäten werden

nah Gröÿe sortiert. Die kleinsten 2 % repräsentieren das Hintergrundsignal b für

das Segment (

bZ

k

). Die Standardabweihung von den kleinsten 2 % Probe Cell -Intensitäten wird berehnet und als Shätzer für die Hintergrundvariabilitätn für

jedes Segment (

nZ

k

)verwendet.

Um einen nahtlosen Übergang zwishen den Segmenten zu gewährleisten, wird der

räumlihe Abstandvon jedemProbeCell aufdem Miroarray zu denvershiedenen

K

-Segmentshwerpunkten mit

d

k

(

x, y

) (

k

= 1

,

· · ·

, L

)

berehnet. Als Gewiht für dieBerehnung des Hintergrunds jeder Probe Cell wird der reziproke Abstand der

jeweiligen Probe Cell zu den

K

-Segmentshwerpunkten berehnet. Deshalb hat ein SegmentmitnaheliegendemShwerpunkteingröÿeres GewihtbeiderBestimmung

des Hintergrundsignals als ein von der Probe-Cell weit entferntes Segment. Die

er-mitteltenGewihte werden mit

w

k

(

x, y

)

bezeihnet. Siekönnen berehnet werden:

w

k

(

x, y

) =

1

d

2

k

(

x, y

) +

i

(2.2)

i is dabei eine Konstante (Voreinstellung = 100), die verhindert, dass der Nenner

Null wird. Mit dem berehneten Segmenthintergrundsignal

b

Z

und den Gewihten

w

k

(

x, y

)

kann man das Hintergrundsignal jeder einzelnen Probe-Cell berehnen:

b

(

x, y

) =

_P

_K

1

k

=1

w

k

(

x, y

)

K

X

k

=1

w

k

(

x, y

)

bZ

k

(2.3)

UmhintergrundbereinigteWerte für jedes Probe-Cell zu erhalten, subtrahiert man

diein(2.3)geshätztenHintergrundwertevondenjeweilsgemessenenProbe-Intensitäten.

DieShätzungdesHintergrundsignalskanngröÿeralsdiegemesseneProbe-Intensität

sein.UmkeinenegativenWertezuerhalten,werdendiehintergrundbereinigten

Wer-tefolgendermaÿenberehnet:

A

(

x, y

) =

max

(

I

′

₍

_{x, y}

₎

₋

_b

₍

_{x, y}

₎

_,

₀

_.

₅

_·

₍

_{x, y}

₎₎

_,

(2.4)

wobei

I

′

₍

_{x, y}

_{) =}

_max

₍

_I

_′

₍

_{x, y}

₎

_,

₀

_.

₅₎

ist.I(x,y)repräsentiertdie

P M

ijk

bzw.die

MM

ijk

mitden jeweiligen Koordinaten x und y.

BeiAymetrixndeteine Normalisierungaufeineranderen Ebene stattalsbeiden

anderen aufgeführten Verfahren. Die Normalisierung wird niht auf Probe-Ebene

durhgeführt, sondern mitden shon aggregiertenWerten des Probesets.

Zielist es, jedem Miroarray mit einem konstanten Wert zu multiplizieren, sodass

alle Mittelwerte gleih dem Mittelwert des Basis-Chips sind. Der erste Miroarray

dient dabei alsBasis-Array. Die übrigen n-1-Arrays werden dann normalisiert:

An-genommen

z

base

derMittelwert derWerte von

z

i

(

z

i

..

=

1

P

m

j

=1

l

j

P

m

j

=1

P

l

j

k

=1

z

ijk

)

.Dannberehnetman

β

i

wie folgt:

β

i

=

z

base

jk

z

i

..

(2.5)

DieExpressionswerte der normalisiertenChips erhält man folgendermaÿen:

z

norm

_ijk

=

β

i

z

ijk

(2.6)

Das beshriebene Skalieren ist äquivalent zu einer linearen Anpassung des

Basis-Arraysanjeden anderen Miroarray miteinemAhsenabshnitt0.Die MM-Signale

repräsentieren das Ausmaÿ der unspezishen Bindung und damit die

Hybridisie-rung von Niht-Zielsequenzen auf dem Miroarray. Verwendet man diese Methode

kommt es zu negativen Signalwerten. Biologish ist dies Unsinn, weil ein Gen

ent-weder ausgeprägt ist oder niht, negativ ausgeprägt kann es niht sein. Aymetrix

änderte deshalb ihren Algorithmus[Aymetrix, 2001℄. Dieser Algorithmus auh

Miroarray Suite 5 (MAS5) genannt verhindert negative Werte nah der

Sub-traktionder PM-Werte vonden MM-Werten.

HateinMM einengröÿerenSignalwert alsdasdazugehörigePMund kommtes

des-halb zum negativem Signalwert, ist einidealer MM (IM) zu wählen, der kleiner als

das PM ist. Deshalb berehnet man zuerst für jedes Probeset einen Probe

spezi-shen Hintergrund, der das durhshnittlihe Verhältnis zwishen PM und MM in

einemProbeset angibt:

SB

ij

=

T

bi

(log

2

(

P M

ijk

)

−

log

2

(

MM

ijk

))

, k

= 1

,

· · ·

, l

j

=

T

bi

log

₂

P M

ijk

MM

ijk

, k

= 1;

_{· · ·}

, l

j

,

(2.7)

dabei ist mit

T

bi

der Tukey's Biweight[Aymetrix, 2002℄ gemeint.Der Tukey's Bi-weightisteinrobusterShätzerfürdenLageparametereinerFunktion.DieFunktion

g(z) und ihre Ableitungsind gegeben durh:

g

(

z

) =







a

2

6

·

[1

−

(1

−

z

2

a

2

)

3

]

für

|

z

| ≤

a

a

2

6

für

|

z

|

> a

(2.8)

g

′

₍

_z

_{) =}







z

(1

−

z

2

a

2

)

2

für

|

z

| ≤

a

0

für

|

z

|

> a

(2.9)

DerShätzwert für den Tukey's Biweightminimiert

X

i

g

(

z

i

−

m

)

(2.10)

füreine gegebene Stihprobe

z

i

, i

= 1

,

· · ·

, n

.

M ist der gesuhte Lageparameter. Im Paket ay wird m zunähst als Median

geshätzt und dann für die

z

i

−

m

wie folgtfortgefahren:Da h dieAbleitungvong ist,gilt

X

i

h

(

z

i

) = 0

(2.11)

und dieGewihtefunktion von

w

(

z

) =

h

(

z

)

/z

für Tukey's Biweightergibt:

w

(

z

) =







(1

−

z

2

a

2

)

2

,

für

|

z

| ≤

a

0

,

für

|

z

|

> a

(2.12)

Datenabhängig von der Anzahl der Ausreiÿer wird der Parameter a gewählt. Der

IM berehnet sih deshalb:

IM

ijk



















MM

ijk

für

MM

ijk

< P M

ijk

P M

ijk

2

S

_B

_ij

für

MM

ijk

≥

P M

ijk

und

SB

ij

> τ

P M

ijk

2

τ /

(1+((

τ

−

SBij

)

/ν

))

für

MM

ijk

≥

P M

ijk

und

SB

ij

≤

τ

Aymetrix shlägt Standardeinstellungen für

τ

und

ν

vor, die bei 0.03 bzw. 10 lie-gen.NahdemmandenIMberehnethat,lassensihPMundMMzusammenfassen:

y

ijk

=

max

(

P M

ijk

−

IM

ijk

, κ

)

,

(2.14)

wobei Aymerix für

κ

eine Standardeinstellung vorgibt

(

κ

= 2

−

20

₎

. Nah der

Pro-be-spezishen Hintergrundkorrektur der Probe-Pair-Werte werden diese zunähst

logarithmiert

(

P V

ijk

=

log

2

(

V

ijk

))

, um die Varianz zu stabilisieren. Mit Tukey Bi-weight [Aymetrix, 2002℄ werden diese logarithmierten Werte zu einem

Expressi-onswert pro Probeset berehnet:

MAS5Signal

ij

=

T

bi

(

P V

ij

1

,

· · ·

, P V

ijl

j

)

(2.15)

DasobenberehneteMAS5SignalwirddannabshlieÿendzurBasiszweiexponiert:

x

ij

= 2

MAS5Signal

ij

(2.16)

2.5.3 Modell von Klein et al.

Klein et al. [Klein et al., 2001℄ haben zur Präprozessierung des Datensatzes von

Küppersetal.dieMethode vonAymetrix(MAS4.0)miteinerglobalenSkalierung

verwendet. Alle negativen Expressionswerte und sehr kleine positive Werte wurden

durh den Wert 20 ersetzt. Eine Denition ab welher Grenze ein Wert als klein

positivklassiziertwirdwird,gebenKleinetal.nihtan.Pialugaetal.verwenden

2.5.4 Das VSN-Modell von Huber et al.

Erst dadurh, dass niht alle Gene nah einem Experiment dierentiell exprimiert

sind, wird eine Normalisierung möglih. Denn nur Probesets, die keine

dierentiel-le Expression zeigen, lassen tehnishe Variabilität erkennen. Bei den

nahfolgen-denPräprozessierungsmodellenwerden ausshlieÿlihdiePM-Werte verwendet.Die

MM-Werte werden falls nötig (so bei Irizarry et al.[Irizarry et al., 2003a℄)

nur für die Hintergrundkorrektur berüksihtigt. Vor der Normalisierung mit VSN

erfolgt keine Hintergrundkorrektur. VSN selbst shätzt und subtrahiert einen

Ge-samthintergrundshätzer(pro Miroarray),sodass eine zusätzlihe

Hintergrundkor-rekturnurbeilokalerVariabilitätübereinenMiroarray, z.B.räumliher Gradient,

sinnvoll wäre.

DerVSN-AlgorithmuslässtsihinzweiKomponentenaufteilen:Beiderersten

han-delt es sih um eine ane Transformation, um die systematishen experimentellen

Faktoren, wie die Markierungsezienz und die Detektionssensivität, zu kalibrieren.

Bei der zweiten handelt es sih um eine

g

log

2

-Transformation, um die Varianz zu stabilisieren[Huberetal.,2002℄.BeideKomponentenwerdenimFolgenden

beshrie-ben.

Das VSN-Modellbasiert auf dem Fehlermodell von Roke und Durbin [Roke and

Durbin, 2001℄. Bei diesem Fehlermodell wird angenommen, dass die gemessene

Si-gnalintensität y eine Realisierung der ZufallsvariablenY ist,die wie folgt deniert

ist:

Y

=

α

+

βe

η

+

ν,

(2.17)

α

istdabeiderOset und

β

dietatsählihgemessene Expression.

e

η

und

ν

sindder multiplikativeundder additiveFehlerterm,wobei

η

mit

N

(0

,

1)

und

ν

mit

N

(0

, s

ν

)

verteilt ist.

AlsErwartungswert von Y ergibt sihdamit:

E

(

Y

) =

E

(

α

+

βe

η

+

ν

)

=

E

(

α

) +

E

(

βe

η

) +

E

(

ν

)

=

α

+

βm

η

(2.18)

wobei

m

η

der Erwartungswert von

e

η

V ar

(

Y

) =

E

(

Y

−

E

(

Y

))

2

=

E

(

α

+

βe

η

+

ν

−

(

α

+

βm

η

))

2

=

E

(

ν

+

β

(

e

η

₋

m

η

))

2

=

E

(

ν

2

+ 2

νβ

(

e

η

−

m

η

) +

β

2

(

e

η

−

m

η

)

2

)

=

E

(

ν

2

_{) +}

_β

2

_E

₍

_e

η

₋

_m

η

)

2

=

s

2

_ν

+

β

2

s

2

_η

(2.19) Dabei sind

s

2

ν

und

s

2

η

die Varianzen von

ν

und

e

η

.

Wenn man die Gleihung 2.18 nah

β

umformt,

β

=

E

(

Y

)

−

a

m

η

(2.20)

und

β

in die Gleihung 2.19 einsetzt, so erhält man die Varianz als Funktion und damitdie quadratishe Abhängigkeit der VarianzvomMittelwert:

v

(

u

) = (

c

1

u

+

c

2

)

2

+

c

3

,

mit

c

3

>

0

(2.21)

v(u)ist dieVarianzals FunktionvomErwartungswert

u

(

→

E

(

Y

))

, wobei

c

1

=

s

η

m

η

, c

2

=

−

αs

η

m

η

, c

3

=

s

2

ν

(2.22)

gegeben ist. Gesuht wird eine Transformation h(y), für die Var(h(y)) = konstant

gilt.Die Methode, dieman indiesem Fallanwendet ist dieDelta-Methode (2.4).

Bei dieser Methode wird h(y) um den Erwartungswert u mit den ersten beiden

Gliedernder Taylor-Reiheapproximiert:

h

(

y

)

≈

h

(

u

) + (

y

−

u

)

h

′

₍

_u

₎

≈

h

(

u

)

−

uh

′

₍

_u

_{) +}

_yh

′

₍

_u

₎

(2.23)