Streszczenie

B

P

−J

, A

N

−K

, A

B. S

WT1

– a New Marker of Leukaemic Cells

WT1

– nowy marker komórek białaczkowych

Katedra i Klinika Hematologii CM UJ w Krakowie Adv Clin Exp Med 2006, 15, 5, 881–887

ISSN 1230−025X

PRACE POGLĄDOWE

Gen WT1(Wilms’ tumor gene) opisano po raz pierwszy w 1990 r. i początkowo identyfikowano jedynie z nerczakiem zarodkowym odkrytym przez Maxa Wilmsa [1, 2]. Gen znajduje się na chromosomie 11p13 i koduje czynnik transkryp− cyjny o budowie palca cynkowego. Ma liczne izo− formy, które współdziałają ze sobą, zapewniając prawidłową funkcję genu [3,4].

Podczas embriogenezy białko WT1 ma wyso− ką ekspresję i bierze udział w regulacji wzrostu i różnicowania komórek, wchodząc w interakcje z genami docelowymi [3]. Ekspresja genu u doro− słych jest ograniczona do warstwy podocytów kłę− buszków nerkowych, komórek Sertoliego w ją− drach, komórek ziarnistych w jajnikach, komórek

mezotelium, gruczołu sutkowego oraz progenito− rowych szpiku [5, 6]. Badania potwierdziły wyso− ką ekspresję genu w chorobach układu hematopo− etycznego: w ostrych białaczkach, przewlekłej białaczce szpikowej, zespołach mielodysplastycz− nych, a także w guzach litych – płuca, tarczycy, sutka, jądra, jajnika oraz w czerniaku [7–11].

Badania, mające za zadanie poznanie funkcji genu, potwierdziły jego rolę w rozwoju nerek, go− nad, różnicowaniu płci, rozwoju siatkówki, mioge− nezie [12–14]. Kreidberg [15] prowadził badania polegające na wprowadzaniu zmutowanego genu

WT1do embrionów mysich. Embriony obumierały w 11. dniu rozwoju zarodkowego w związku z nie− prawidłowym rozwojem nerek, gonad, a także me−

© Copyright by Silesian Piasts University of Medicine in Wrocław

Streszczenie

Gen WT1znajduje się na chromosomie 11p13 i koduje czynnik transkrypcyjny o budowie palca cynkowego dla białek odpowiedzialnych za regulację wzrostu i różnicowania komórkowego. Jego ekspresję wykazano podczas rozwoju embrionalnego różnych tkanek zwierzęcych, a także w tkankach nowotworowych u ludzi oraz w ostrych białaczkach. Ekspresja WT1 na komórkach blastycznych większości ostrych białaczek i jej brak na prawidłowych komórkach hemopoetycznych, w tym komórkach progenitorowych CD34+ _{pozwala na użycie go jako nowego} markera służącego do oceny minimalnej choroby resztkowej u chorych na ostre białaczki. Nadekspresję genu WT1 wykazano w przewlekłej białaczce szpikowej oraz guzach litych. Białko WT1 indukuje wytwarzanie swoistych cy− totoksycznych limfocytów T i może być antygenem docelowym w celowanej immunoterapii chorób nowotworo− wych (Adv Clin Exp Med 2006, 15, 5, 881–887).

Słowa kluczowe: embriogeneza, leukemogeneza, ostre białaczki, MDS, PBS, minimalna choroba resztkowa, im− munoterapia.

Abstract

The WT1gene is located on chromosome 11p13 and encodes a zinc finger motif−containing transcription factor in− volved in regulation of growth and differentiation. Its expression was shown during embryonic development in va− rious tissues in animal models as well as in a few human malignancies including acute leukemias. Its expression in the majority of human acute leukemias but not in normal mononuclear blood cells and normal CD34+_{hematopoie−} tic progenitors qualifies the WT1gene transcript as a ‘pan−acute leukemic’ marker probably useful in monitoring mi− nimal residual disease after chemotherapy. WT1 is overexpressed in chronic myeloid leukemia and various types of solid tumors, and the WT1 protein was demonstrated to be an attractive target antigen for immunotherapy against these malignancies induceing WT1−specific cytotoxic T lymphocytes (Adv Clin Exp Med 2006, 15, 5, 881–887).

zotelium, serca i płuc. Badanie to potwierdziło klu− czową rolę genu w rozwoju tych narządów.

Rola genu w leukemogenezie nie jest do koń− ca poznana. Ellisen [16] badał wpływ izoform ge− nu WT1na ludzkie komórki progenitorowe szpiku oraz komórki białaczkowe. Wykrył, że izoformy genu WT1 zatrzymywały wzrost obu typów ko− mórek w fazie G1, zmniejszając liczbę komórek w fazie S cyklu komórkowego, indukowały ich różnicowanie, jednocześnie wpływając hamująco na wczesne prekursory linii hematopoetycznych. Prowadzone badania wskazują, że funkcja genu zmienia się zależnie od stadium, w jakim znajduje się prekursorowa komórka hematopoetyczna. Ba− dania, mające na celu zahamowanie ekspresji WT1

przez oligonukleotydy antysensowe, prowadziły do wstrzymania proliferacji i stymulacji apoptozy komórek białaczkowych [17, 18].

Mutacje w genie WT1 powodują utratę przez niego funkcji regulacyjnej i w następstwie rozwój wrodzonych anomalii obserwowanych w zespole Denys−Dresh, Frasiera oraz zespole WAGR. Muta− cje genu WT1wykryto także w nerczaku niedojrza− łym, białaczkach, zespołach mielodysplastycznych, w znacznie mniejszym jednak odsetku przypadków [19, 20]. Zestawienie ekspresji genu WT1w choro− bach nowotworowych przedstawia tabela 1.

Ekspresja

WT1

w ostrych białaczkach

Pierwsze dane dotyczące powiązania WT1

z białaczką opublikował Call i jego współpracow− nicy w 1990 r. [1]. Obecnie stosowane metody biologii molekularnej pozwalają na wykrycie eks− presji genu WT1w ponad 90% komórek białacz− kowych zarówno w ostrej białaczce szpikowej, jak i limfoblastycznej [21–25]. Próbki szpiku i krwi obwodowej w chwili diagnozy i nawrotu wykazy− wały znacznie większy poziom ekspresji WT1

w porównaniu z chorymi podczas remisji oraz zdrowymi dawcami. Obserwuje się odwrotnie pro−

porcjonalną zależność między ekspresją WT1

i stopniem zróżnicowania komórek. Potwierdza to mniejsza ekspresja WT1u chorych na AML M5− M7 według klasyfikacji FAB [26, 27], a także brak ekspresji na komórkach przewlekłej białaczki lim− focytowej i białaczki włochatokomórkowej. Gen

WT1uznano za marker mający niekorzystne zna− czenie rokownicze w ostrych białaczkach [28–30]. W badaniu grupy badaczy z Manchester [28] iloś− ciowa analiza transkryptu WT1 u chorych na ostre białaczki w chwili rozpoznania korelowała z czę− stością uzyskania remisji, przeżyciem wolnym od choroby oraz całkowitym przeżyciem. W obrębie grup z korzystnym i pośrednim ryzykiem cytoge− netycznym duże stężenie WT1 wiązało się z gor− szym rokowaniem. Pacjenci mający małe stężenie kopii genu po indukcji i konsolidacji osiągali lep− sze przeżycie. Kilka ostatnio opublikowanych do− niesień podważa znaczenie rokownicze powyższe− go markera [25, 31]. Oceniano obecność genu WT

i innych 10 genów fuzyjnych za pomocą metody

multiplex real−time RT−PCR [25]. Poziomy eks− presji korelowały z procentowym zajęciem szpiku przez naciek białaczkowy, nie stwierdzono jednak korelacji między wyjściowym stężeniem genu

WT1a przeżyciem wolnym od choroby i całkowi− tym przeżyciem. Prowadzono badania dotyczące koekspresji genu bcl−2iWT1[32]. W grupie cho− rych poniżej 60. r. życia koekspresja tych genów wiązała się z mniejszym odsetkiem uzyskanych remisji oraz z krótszym przeżyciem w porównaniu z pacjentami powyżej 60. r. życia, u których nie stwierdzono powyższej zależności. Badacze za− proponowali zdefiniowanie nowych grup ryzyka na podstawie poziomu ekspresji genów WT1

ibcl2.

Ekspresja

WT1

w CML

Są prowadzone także badania dotyczące wy− korzystania genu WT1w monitorowaniu choroby resztkowej u chorych na przewlekłą białaczkę

Tabela 1. Zestawienie ekspresji WT1w chorobach nowotworowych

Table 1. WT1expression in malignancies

Choroby nowotworowe układu krwiotwórczego Nowotwory złośliwe

(Hematopoietic malignances) (Tumors)

Ostra białaczka mieloblastyczna płuc

Ostra białaczka limfoblastyczna sutka

Zespoły mielodysplastyczne jąder

Przewlekła białaczka szpikowa jajnika

szpikową (CML – chronic myeloid leukaemia) le− czonych za pomocą imatinibu – inhibitora kinazy tyrozynowej, hamującego aktywność białka fuzyj− nego bcr/abl. Sugeruje się, że WT1 może być uży− tecznym markerem choroby resztkowej zarówno przed, jak i po terapii imitanibem, a ilość trans− kryptu może być predyktorem odpowiedzi na to leczenie [33]. W fazie chronicznej chorzy mogą być monitorowani za pomocą metody RQ−PCR, w przypadku bardziej zaawansowanych stadiów choroby udaje się to tylko u nielicznych chorych [34]. Podjęto także próbę przewidywania odpo− wiedzi na imatinib na podstawie poziomu ekspre− sji genu WT1w komórkach szpiku inkubowanych wraz z lekiem przez 18 godz. [35]. Ekspresja genu była znacznie niższa w próbkach chorych, którzy dobrze odpowiedzieli na leczenie imatinibem [36]. Zmniejszenie ekspresji transkryptu genu WT1ko− relowało z zahamowaniem wzrostu kolonii hema− topoetycznych w hodowli in vitro. Nie wykazano natomiast użyteczności badania ekspresji genu

WT1w przewidywaniu nawrotu po allogenicznej transplantacji szpiku w porównaniu z transkryp− tem BCR/ABL.

Ekspresja

WT1

w MDS

Zespoły mielodysplastyczne są heterogenną grupą chorób. Powszechnie stosowana klasyfikacja kliniczna International Prognostic Scoring System (IPSS) uwzględnia odsetek blastów w szpiku i krwi obwodowej oraz kariotyp i stopień cytopenii we krwi obwodowej. Prowadzone badania wskazują, że poziom ekspresji genu WT1wzrasta wraz z pro− gresją choroby [37, 26]. Oceniono materiał pobra− ny u 131 chorych, w tym: 79 z RA, 31 z RAEB, 18 z AML, 3 z delecją 5q [37]. W przypadku 65% próbek szpiku i 78% krwi chorych z RA oraz w przypadku 100% chorych z typem RAEB i AML ekspresja WT1 była większa od obserwowanej u zdrowych dawców. Wyniki korelowały zliczbą blastów w szpiku, liczbą zmian cytogenetycz−

nych oraz IPPS. Wykazano także dużą czułość

stosowanych testów ilościowych w monitorowaniu choroby resztkowej w MDS [38].

W 2003 r. przeprowadzono badania potwier− dzające skuteczność immunoterapii wykorzystują− cej WT1 jako antygen docelowy u chorych z ze− społami mielodysplastycznymi oraz ostrymi bia− łaczkami [39]. Pacjentom podawano podskórnie szczepionki zawierające peptyd WT1, które indu− kowały powstanie limfocytów T cytotoksycznych, a w rezultacie potwierdziło zmniejszenie liczby komórek blastycznych.

Ekspresja

WT1

w komórkach CD34

Ocena ekspresji genu WT1 w prawidłowych komórkach CD34+ _{jest kluczowa w przypadku}

rozważań dotyczących wykorzystania tego genu jako narzędzia w terapii celowanej [40, 41]. Pod− czas immunoterapii powinno nastąpić niszczenie komórek białaczkowych bez wpływu na prawidło− wą hematopoezę. Ekspresję WT1 stwierdza się w przypadku prawidłowych komórek progenitoro− wych szpiku. Udowodniono to w badaniach in vi− trow 12−dniowych hodowlach wyizolowanych ze szpiku komórek CD34+ _{inkubowanych z SCF}

(stem cell factor) i G−CSF [41]. Ekspresja WT1by− ła największa w pierwszym i drugim dniu hodow− li, następnie wraz z różnicowaniem do stadium granulocyta gwałtownie zmniejszała się, co suge− ruje, że WT1 może być czynnikiem regulującym hematopoezę na wczesnym etapie rozwoju [42]. Japońscy naukowcy [43] w celu oceny poziomu ekspresji genu WT1 w komórkach progenitoro− wych szpiku i krwi pępowinowej sortowali ko− mórki zależnie od ekspresji CD34, CD33, CD38, HLA−DR, c−kit. Poziom ekspresji w prawidło− wych komórkach hematopoetycznych CD34+

i CD34 był około dziesięć razy mniejszy niż w ko− mórkach białaczkowych. W innym badaniu oce− niano komórki CD34 pochodzące od zdrowych dawców. Stwierdzono, że 1,2% komórek wykazy− wało ekspresję WT1, a poziom był porównywalny z poziomem w linii komórkowej K562. Wysunię− to więc koncepcję, że komórki CD34(+)_{WT1 po−}

zytywne mogą być elementem klonu białaczkowe− go. Wiele badań, w tym doświadczenia z wykorzy− staniem oligonukleodydów antysensowych potwierdziło, że gen WT1jest konieczny do roz− woju klonu białaczkowego [17, 18, 44, 45].

Zastosowanie genu

WT1

w monitorowaniu

choroby resztkowej

Monitorowanie choroby resztkowej (MRD – minimal residual disease) jest bardzo ważne w przewidywaniu ewentualnego nawrotu u chorych na ostre białaczki. Istotne znacznie ma możliwość rozpoznania genu o znacznie większym rozpo− wszechnieniu wśród komórek białaczkowych, przy jednoczesnej małej ekspresji w prawidłowych ko− mórkach organizmu. Warunki te spełnia gen WT1

chodzących od zdrowych dawców. Gen ten można wykorzystać zwłaszcza w przypadku białaczek, niemających markerów o potwierdzonej wcześniej skuteczności, jakimi są geny fuzyjne.

Wstępne badania z użyciem testów jakościo− wych i półilościowych prezentowały sprzeczne wyniki [27, 31, 46–48]. Część badaczy opisywała brak korelacji między ekspresją WT1 w chwili rozpoznania i uzyskaniem całkowitej remisji, a niektórzy wskazywali na możliwość osiągnięcia remisji u większego odsetka chorych z małą eks− presją genu. Różnice mogły być związane ze sto− sowaniem metod badawczych o różnej czułości. Obecnie stosowane metody, w tym technika iloś− ciowa PCR w czasie rzeczywistym (Real−Time Quantitive PCR−RQ−PCR), pozwalają na wykry− cie ekspresji genu WT1w prawie wszystkich ko− mórkach białaczkowych, zarówno w ostrej bia− łaczce szpikowej, jak i limfoblastycznej [22, 24, 28, 37, 49]. Poziom ekspresji genu WT1korelował z poziomem ekspresji innych markerów nowotwo− rowych, jakimi są geny fuzyjne stwierdzane u cho− rych na ostre białaczki [50, 51]. Monitorowanie poziomu ekspresji genu WT1pozwala przewidzieć nawrót choroby na średnio 4–6 miesięcy przed wystąpieniem objawów klinicznych nawrotu.

Badania dotyczące skuteczności śledzenia MRD po allotransplantacji potwierdziły dużą sku− teczność WT1 w ocenie MRD u chorych na ostre białaczki [52, 53]. Podkreśla się, że czułość detek− cji MRD jest 100 razy większa w komórkach krwi obwodowej w porównaniu z komórkami szpiku i wynosi dla krwi 10–5_{, a szpiku 10}–3_–10–4_{[28, 37,}

47, 51, 54].

Białko WT1 jako cel

immunoterapii

W związku z dużą ekspresją genu WT1w bia− łaczkach oraz wielu typach guzów litych wydaje się, że białko WT1 jest atrakcyjnym antygenem docelowym immunoterapii. Badania na modelu

zwierzęcym, wykorzystujące szczepionki zawiera− jące peptydy WT1, pobudzały odpowiedź T ko− mórkową, której rezultatem była eliminacja ko− mórek mających ekspresję WT1 [56, 55]. Prowa− dzono badania mające na celu generowanie limfocytów T cytotoksycznych (CTLs – cytotoxic T cells) u zdrowych dawców skierowanych prze− ciwko epitopom HLA−A2, HLA−A24 swoistym, w celu zniszczenia komórek WT1 pozytywnych [57–62]. Potwierdzono, że w organizmie osób zdrowych i chorych są obecne przeciwciała WT1 swoiste. Rozpoznano je u 15–25% chorych na AML, 19% na CML oraz u 2% zdrowych bada− nych [63–65]. Ponieważ białko WT1 występuje w zdrowych komórkach, istnieje niebezpieczeń− stwo, że po zastosowaniu szczepionki nastąpi pro− ces autoimmunizacji. W badaniach prowadzonych u zwierząt dzięki immunizacji fragmentami białek lub DNA WT1 uzyskiwano limfocyty T cytotok− syczne niewykazujące reakcji cytotoksycznej wo− bec narządów [56, 66]. W doświadczeniach stwierdzano nie tylko niszczenie linii komórko− wych wykazujących ekspresję WT1, ale także za− pobieganie zwiększaniu się guza składającego się z tych komórek w warunkach in vivo[67]. Opubli− kowano pierwsze wyniki badania I fazy wykorzy− stującego powyższą immunoterapię w grupie 26 chorych na raka sutka, płuc, zespół mielodyspla− styczny oraz ostrą białaczkę szpikową [68]. Cho− rym podawano śródskórnie białko WT1. U pacjen− tów chorych na MDS poza miejscowym rumie− niem obserwowano leukopenię. U 12/20 chorych, u których była możliwa ocena odpowiedzi na le− czenie, stwierdzono zmniejszenie liczby komórek blastycznych lub rozmiaru guza, a także stężenia charakterystycznych dla nich markerów. Istniała korelacja między liczbą generowanych po szcze− pieniu limfocytów T cytotoksycznych a odpowie− dzią kliniczną. Badanie to potwierdziło fakt, że możliwe jest indukowanie odpowiedzi immunolo− gicznej skierowanej przeciwko nowotworom z na− stępowym zmniejszeniem masy guza, bez uszko− dzenia prawidłowych tkanek organizmu.

Piśmiennictwo

[1] Call KM, Glaser T, Ito CY, Buckler AJ, Pelletier I, Haber DA, Rose EA, Kral A, Yeger H, Lewis WH: Iso− lation and characterization of a zinc finger polypeptide gene at the human chromosome 11 Wilms’ tumor locus. Cell 1990, 60, 509–520.

[2] Rose EA, Glaser T, Jones C, Smith CL, Lewis WH, Call KM, Minden M, Champagne E, Bonetta L, Yeger H, Housman DE: Complete physical map of the WAGR region of 11p13 localizes a candidate Wilms’ tumor ge− ne. Cell 1990, 60, 405–508.

[3] Haber DA, Sohn RL, Buckler AJ, Pelletier J, Call KM, Housman DE: Alternative splicing and genomic struc− ture of the Wilms tumor gene WT1. Proc Natl Acad Sci 1991, 88, 9618–9622.

[4] Laity JH, Dyson HJ, Wright PE: Molecular basis for modulation of biological function by alternate splicing of the Wilms’ tumor suppressor protein. Proc Nat Acad Sci 2000, 97, 11932–11935.

[6] Mundlos S, Pelletier J, Darveau A, Bachmann M, Winterpacht A, Zabel B: Nuclear localization of the prote− in encoded by the Wilms’ tumor gene WT1in embryonic and adult tissues. Development 1993, 119, 1329–1341.

[7] Miwa H, Beran M, Saunders GF: Expression of the Wilms’ tumor gene (Wt1) in human leukemias. Leukemia 1992, 6, 405–409.

[8] Bruening W, Gros P, Sato T, Housman D, Pelletier J: Analysis of the 11p13 Wilms’ tumor suppressor gene (WT1) in ovarian tumors. Cancer Invest 1993, 11, 393–399.

[9] Rodeck U, Bossler A, Kari C, Humphreys CW, Gyorfi T, Maurer J, Thiel E, Menssen HD: Expression of the Wt1Wilms’ tumor gene by normal and malignant human melanocytes. Int J Cancer 1994, 59, 78–82.

[10] Silberstein GB, Van Horn K, Strickland P, Roberts CT Jr, Daniel CW: Altered expression of the WT1Wilms tumor suppressor gene in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci 1997, 94, 8132–8137.

[11] Tisljar K, Linnerth B, Priglinger S: Detection of WT1gene expression in patients with solid tumors. Br J Hae− matol 1996, 93, 201.

[12] Hossain A, Saunders GF: The human sex−determining gene SRYis a direct target of WT1. J Biol Chem 2001, 276, 16817–16823.

[13] Wagner K D, Wagner N, Vidal VPI, Schley G, Wilhelm D, Schedl A Englert C, Scholz H: The Wilms’ tumor gene Wt1 is required for normal development of the retina. EMBO J 2002, 21, 1398–1405.

[14] Miyagawa K, Kent J, Moore A, Charlieu J−P, Little MH, Williamson KA, Kelsey A, Brown KW, Hassam S, Briner J, Hayashi Y, Hirai H, Yazaki Y, van Heyningen V, Hastie ND: Loss of WT1 function leads to ectopic myogenesis in Wilms’ tumour. (Letter) Nature Genet 1998, 18, 15–17.

[15] Kreidberg JA, Sariola H, Loring JM, Maeda M, Pelletier J, Housman D, Jaenisch R: WT−1 is required for early kidney development. Cell 1993, 74, 679–691.

[16] Ellisen LW, Carlesso N, Cheng T, Scadden DT, Haber DA: The Wilms tumor suppressor WT1 directs stage− specific quiescence and differentiation of human hematopoietic progenitor cells. EMBO J 2001, 20, 1897–1909.

[17] Algar EM, Khromykh T, Smith SI, Blackburn DM, Bryson GJ, Smith PJ: A WT1 antisense oligonucleotide inhibits proliferation and induces apoptosis in myeloid leukemia cell lines. Oncogene 1996, 12, 1005–1014.

[18] Yamagami T, Sugiyama H, Inoue K, Ogawa H, Tatekawa T, Hirata M, Kudoh T, Akiyama T, Murakami A, Maekawa T: Growth inhibition of human leukemic cells by WT1(Wilms tumor gene) antisense oligodeoxynuc− leotides: implications for the involvement of WT1 in leukemogenesis. Blood 1996, 87, 2878–2884.

[19] Hosoya N, Miyagawa K, Mitani K, Yazaki Y, Hirai H: Mutation analysis of the WT1gene in myelodysplastic syndromes. Jpn J Cancer Res 1998, 89, 821–824.

[20] King−Underwood L, Pritchard−Jones K: Wilms’ tumor (WT1) gene mutations occur mainly in acute myeloid leukemia and may confer drug resistance. Blood 1998, 91, 2961–2968.

[21] Fukahori S: Quantification of WT1 mRNA by competitive NASBA in AML patients. Kurume Med J 2001, 48, 129–134.

[22] Kreuzer KA, Saborowski A, Lupberger J, Appelt C, Na IK, le Coutre P, Schmidt CA: Fluorescent 5’−exo− nuclease assay for the absolute quantification of Wilms’ tumour gene (WT1) mRNA: implications for monitoring human leukaemias. Br J Haematol 2001, 114, 313–318.

[23] Siehl JM, Reinwald M, Heufelder K, Menssen HD, Keilholz U, Thiel E: Expression of Wilms’ tumor gene 1 at different stages of acute myeloid leukemia and analysis of its major splice variants. Ann Hematol 2004, 83, 745–750.

[24] Tamaki H, Mishima M, Kawakami M, Tsuboi A, Kim EH, Hosen N, Ikegame K, Murakami M, Fujioka T, Masuda T, Taniguchi Y, Nishida S, Osumi K, Soma T, Oji Y, Oka Y, Kawase I, Sugiyama H, Ogawa H: Mo− nitoring minimal residual disease in leukemia using real−time quantitative polymerase chain reaction for Wilms tumor gene (WT1). Int J Hematol 2003, 78, 349–356.

[25] Yanada M, Terakura S, Yokozawa T, Yamamoto K, Kiyoi H, Emi N, Kitamura K, Kohno A, Tanaka M, To− bita T, Takeo T, Sao H, Kataoka T, Kobayashi M, Takeshita A, Morishita Y, Naoe T, Sugiura I: Multiplex real−time RT−PCR for prospective evaluation of WT1 and fusion gene transcripts in newly diagnosed de novoacu− te myeloid leukemia. Leuk Lymphoma 2004, 45, 1803–1808.

[26] Patmasiriwat P, Fraizer G, Kantarjian H, Saunders GF: WT1 and GATA1 expression in myelodysplastic syn− drome and acute leukemia. Leukemia 1999, 13, 891–900.

[27] Bergmann L, Miething C, Maurer U, Brieger J, Karakas T, Weidmann E, Hoelzer D: High levels of Wilms’ tumor gene (WT1) mRNA in acute myeloid leukemias are associated with a worse long−term outcome. Blood 1997, 90, 1217–1225.

[28] Garg M, Moore H, Tobal K, Liu Yin JA: Prognostic significance of quantitative analysis of WT1gene trans− cripts by competitive reverse transcription polymerase chain reaction in acute leukaemia. Br J Haematol 2003, 123, 49–59.

[29] Barragan E, Cervera J, Bolufer P, Ballester S, Martin G, Fernandez P, Collado R, Sayas MJ, Sanz MA: Pro− gnostic implications of Wilms’ tumor gene (WT1) expression in patients with de novo acute myeloid leukemia. Haematologica 2004, 89, 926–933.

[30] Huang Z, Xiao B, Chen S, Li S, Liu Y, Liu J: Studies of WT1gene expression in leukemia patients. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi 2002, 23, 367–369.

[32] Karakas T, Miething CC, Maurer U, Weidmann E, Ackermann H, Hoelzer D, Bergmann L: The coexpres− sion of the apoptosis−related genes bcl−2and WT1in predicting survival in adult acute myeloid leukemia. Leuke− mia 2002, 16, 846–854.

[33] Cilloni D, Saglio G: Usefulness of quantitative assessment of Wilms tumor suppressor gene expression in chro− nic myeloid leukemia patients undergoing imatinib therapy. Semin Hematol 2003, 40, 37–41.

[34] Na IK, Kreuzer KA, Lupberger J, Dorken B, Coutre P: Quantitative RT−PCR of Wilms tumor gene transcripts (WT1) for the molecular monitoring of patients with accelerated phase bcr/abl + CML. Leuk Res 2005, 29, 343–345.

[35] Cilloni D, Messa F, Gottardi E, Fava M, Arruga F, Defilippi I, Carturan S, Messa E, Morotti A, Giugliano E, Rege−Cambrin G, Alberti D, Baccarani M, Saglio G: Sensitivity to imatinib therapy may be predicted by test− ing Wilms tumor gene expression and colony growth after a short in vitro incubation. Cancer 2004, 101, 979–988.

[36] Uzunel M, Ringden O: Poor correlation of kinetics between BCR−ABL and WT1 transcript levels after alloge− neic stem cell transplantation. Bone Marrow Transplant 2004, 33, 47–52.

[37] Cilloni D, Gottardi E, Messa F, Fava M, Scaravaglio P, Bertini M, Girotto M, Marinone C, Ferrero D, Gal− lamini A, Levis A, Saglio G: Piedmont Study Group on Myleodysplastic Syndromes. Significant correlation be− tween the degree of WT1 expression and the International Prognostic Scoring System Score in patients with my− elodysplastic syndromes. J Clin Oncol 2003, 21, 1988–1995.

[38] Tamaki H, Ogawa H, Ohyashiki K, Ohyashiki JH, Iwama H, Inoue K, Soma T, Oka Y, Tatekawa T, Oji Y, Tsuboi A, Kim EH, Kawakami M, Fuchigami K, Tomonaga M, Toyama K, Aozasa K, Kishimoto T, Sugiy− ama H: The Wilms’ tumor gene WT1is a good marker for diagnosis of disease progression of myelodysplastic syndromes. Leukemia 1999, 13, 393–399.

[39] Oka Y, Tsuboi A, Murakami M, Hirai M, Tominaga N, Nakajima H, Elisseeva OA, Masuda T, Nakano A, Kawakami M, Oji Y, Ikegame K, Hosen N, Udaka K, Yasukawa M, Ogawa H, Kawase I, Sugiyama H:

Wilms tumor gene peptide−based immunotherapy for patients with overt leukemia from myelodysplastic syndro− me (MDS) or MDS with myelofibrosis. Int J Hematol 2003, 78, 56–61.

[40] Baird PN, Simmons PJ: Expression of the Wilms’ tumor gene (WT1) in normal hemopoiesis. Exp Hematol 1997, 25, 312–320.

[41] Maurer U, Brieger J, Weidmann E: Rhe Wilms’ tumor gene is expressed in a subset of CD34+ progenitors and downregulated early in the course of differentiation in vitro. Exp Hematol 1997, 25, 945–950.

[42] Inoue K, Ogawa H, Sonoda Y, Kimura T, Sakabe H, Oka Y, Miyake S, Tamaki H, Oji Y, Yamagami T, Ta− tekawa T, Soma T, Kishimoto T, Sugiyama H: Aberrant overexpression of the Wilms tumor gene (WT1) in hu− man leukemia. Blood 1997, 89, 1405–1412.

[43] Hosen N, Sonoda Y, Oji Y, Kimura T, Minamiguchi H, Tamaki H, Kawakami M, Asada M, Kanato K, Mo− tomura M, Murakami M, Fujioka T, Masuda T, Kim EH, Tsuboi A, Oka Y, Soma T, Ogawa H, Sugiyama H:

Very low frequencies of human normal CD34+ haematopoietic progenitor cells express the Wilms’ tumour gene WT1at levels similar to those in leukaemia cells. Br J Haematol 2002, 116, 409–420.

[44] Inoue K, Tamaki H, Ogawa H, Oka Y, Soma T, Tatekawa T, Oji Y, Tsuboi A, Kim EH, Kawakami M, Akiy− ama T, Kishimoto T, Sugiyama H: Wilms’ tumor gene (WT1) competes with differentiation−inducing signal in hematopoietic progenitor cells. Blood 1998, 91, 2969–2976.

[45] Mi Y, Wang L, Bian S, Meng Q, Chen G, Wang J: Effect of WT1gene expression on cell growth and prolife− ration in myeloid leukemia cell lines. Chin Med J 1999, 112, 705–708.

[46] Gaiger A, Schmid D, Heinze G, Linnerth B, Greinix H, Kalhs P, Tisljar K, Priglinger S, Laczika K, Mitter− bauer M, Novak M, Mitterbauer G, Mannhalter C, Haas OA, Lechner K, Jager U: Detection of the WT1 transcript by RT−PCR in complete remission has no prognostic relevance in de novo acute myeloid leukemia. Leu− kemia 1998, 12, 1886–1894.

[47] Inoue K, Ogawa H, Yamagami T, Soma T, Tani Y, Tatekawa T, Oji Y, Tamaki H, Kyo T, Dohy H, Hiraoka A, Masaoka T, Kishimoto T, Sugiyama H: Long−term follow−up of minimal residual disease in leukemia pa− tients by monitoring WT1(Wilms tumor gene) expression levels. Blood 1996, 88, 2267–2278.

[48] Inoue K, Sugiyama H, Ogawa H, Nakagawa M, Yamagami T, Miwa H, Kita K, Hiraoka A, Masaoka T, Na− su K: WT1 as a new prognostic factor and a new marker for the detection of minimal residual disease in acute leukemia. Blood 1994, 84, 3071–3079.

[49] Cilloni D, Saglio G: WT1 as a universal marker for minimal residual disease detection and quantification in my− eloid leukemias and in myelodysplastic syndrome. Acta Haematol 2004, 112, 79–84.

[50] Ostergaard M, Olesen LH, Hasle H, Kjeldsen E, Hokland P: WT1gene expression: an excellent tool for mo− nitoring minimal residual disease in 70% of acute myeloid leukaemia patients – results from a single−centre stu− dy. Br J Haematol 2004, 125, 590–600.

[51] Cilloni D, Gottardi E, De Micheli D, Serra A, Volpe G, Messa F, Rege−Cambrin G, Guerrasio A, Divona M, Lo Coco F, Saglio G: Quantitative assessment of WT1 expression by real time quantitative PCR may be a useful tool for monitoring minimal residual disease in acute leukemia patients. Leukemia 2002,16, 2115–2121.

[53] Ogawa H, Ikegame K, Kawakami M, Tamaki H: WT1gene transcript assay for relapse in acute leukemia after transplantation. Leuk Lymphoma 2004, 45, 1747–1753.

[54] Sugiyama H: Wilms’ tumor gene (WT1) as a new marker for the detection of minimal residual disease in leuke− mia. Leuk Lymphoma 1998, 30, 55–61.

[55] Gaiger A, Reese V, Disis ML, Cheever MA: Immunity to WT1 in the animal model and in patients with acute myeloid leukemia. Blood 2000, 96, 1480–1489.

[56] Tsuboi A, Oka Y, Ogawa H, Eliseeva OA, li H, Kawasaki K, Aozasa K, Kishimoto T, Udaka K, Sugiyama H:

Cytotoxic T−lymphocyte responses elicited to Wilms’ tumor gene WT1 product by DNA vaccination. J Clin Im− munol 2000, 20, 195–202.

[57] Gao L, Bellantuono I, Elsasser A, Marley SB, Gordon MY, Goldman JM, Stauss HJ: Selective elimination of leukemic CD34(+) progenitor cells by cytotoxic T lymphocytes specific for WT1. Blood 2000, 95, 2198–2203.

[58] Ohminami H, Yasukawa M, Fujita S: HLA class I−restricted lysis of leukemia cells by a CD8(+) cytotoxic T−lymphocyte clone specific for WT1 peptide. Blood 2000, 95, 286–293.

[59] Oka Y, Elisseeva OA, Tsuboi A, Ogawa H, Tamaki H, Li H, Oji Y, Kim EH, Soma T, Asada M, Ueda K, Ma− ruya E, Saji H, Kishimoto T, Udaka K, Sugiyama H: Human cytotoxic T−lymphocyte responses specific for peptides of the wild−type Wilms’ tumor gene (WT1) product. Immunogenetics 2000, 51, 99–107.

[60] Savage P, Gao L, Vento K, Cowburn P, Man S, Steven N, Ogg G, McMichael A, Epenetos A, Goulmy E, Stauss HJ: Use of B cell−bound HLA−A2 class I monomers to generate high−avidity, allo−restricted CTLs against the leukemia−associated protein Wilms tumor antigen. Blood 2004, 103, 4613–4615.

[61] Tsuji T, Yasukawa M, Matsuzaki J, Ohkuri T, Chamoto K, Wakita D, Azuma T, Niiya H, Miyoshi H, Ku− zushima K, Oka Y, Sugiyama H, Ikeda H, Nishimura T: Generation of human tumor−specific, HLA class I−re− stricted Th1 and Tc1 cells by cell engineering with tumor peptide−specific T cell receptor genes. Blood 2005, 106, 470–476.

[62] Guo Y, Niiya H, Azuma T, Uchida N, Yakushijin Y, Sakai I, Hato T, Takahashi M, Senju S, Nishimura Y, Yasukawa M: Direct recognition and lysis of leukemia cells by WT1−specific CD4+ T lymphocytes in an HLA class II−restricted manner. Blood 2005, 106, 1415–1418.

[63] Elisseeva OA, Oka Y, Tsuboi A, Ogata K, Wu F, Kim EH, Soma T, Tamaki H, Kawakami M, Oji Y, Hosen N, Kubota T, Nakagawa M, Yamagami T, Hiraoka A, Tsukaguchi M, Udaka K, Ogawa H, Kishimoto T, No− mura T, Sugiyama H: Humoral immune responses against Wilms tumor gene WT1product in patients with he− matopoietic malignancies. Blood 2002, 99, 3272–3279.

[64] Gaiger A, Carter L, Greinix H, Carter D, Mc Neill PD, Houghton RL, Cornellison CD, Vedvick TS, Skeiky YA, Cheever MA: WT1 specific serum antibodies in patients with leukemia. Clin Cancer Res 2001, 7, 761–765.

[65] Wu F, Oka Y, Tsuboi A, Elisseeva OA, Ogata K, Nakajima H, Fujiki F, Masuda T, Murakami M, Yoshiha− ra S, Ikegame K, Hosen N, Kawakami M, Nakagawa M, Kubota T, Soma T, Yamagami T, Tsukaguchi M, Ogawa H, Oji Y, Hamaoka T, Kawase I, Sugiyama H: Th1−biased humoral immune responses against Wilms tumor gene WT1product in the patients with hematopoietic malignancies. Leukemia 2005, 19, 268–274.

[66] Oka Y, Udaka K, Tsuboi A, Elisseeva OA, Ogawa H, Aozasa K, Kishimoto T, Sugiyama H: Cancer immuno− therapy targeting Wilms’ tumor gene WT1product. J Immunol 2000, 164, 1873–1880.

[67] Mailander V, Scheibenbogen C, Thiel E, Letsch A, Blau IW, Keilholz U: Complete remission in a patient with recurrent acute myeloid leukemia induced by vaccination with WT1 peptide in the absence of hematological or renal toxicity. Leukemia 2004, 18, 165–166.

[68] Oka Y, Tsuboi A, Taguchi T, Osaki T, Kyo T, Nakajima H, Elisseeva OA, Oji Y, Kawakami M, Ikegame K, Hosen N, Yoshihara S, Wu F, Fujiki F, Murakami M, Masuda T, Nishida S, Shirakata T, Nakatsuka S, Sa− saki A, Udaka K, Dohy H, Aozasa K, Noguchi S, Kawase I, Sugiyama H: Induction of WT1(Wilms’ tumor gene)−specific cytotoxic T lymphocytes by WT1 peptide vaccine and the resultant cancer regression. Proc Natl Acad Sci 2004, 101, 1385–1390.

Adres do korespondencji:

Beata Piątkowska−Jakubas Katedra Hematologii CM UJ ul. Kopernika 17

31−501 Kraków tel.: +48 012 424 74 26

Conflict of interest: None declared

Praca wpłynęła do Redakcji: 24.01.2006 r. Po recenzji: 9.05.2006 r.

Zaakceptowano do druku: 21.09.2006 r.