3.2 Prostate Cancer Study
3.2.1 Mining Histopathology Reports
3.2.1.6 Algorithm Results and Evaluation
4.1-
Extracción y Purificación de RNA.
4.1.1- Extracción de RNA total de chopo.
Se partió de 2 g de muestra, pulverizada en nitrógeno líquido y conservada a -80ºC, a los que se añadió 15 mL de tampón de extracción [CTAB 2% (p/v); PVP K30 2% (p/v); Tris-HCl 100 mM, pH 8,0; EDTA 25 mM, pH 8,0; NaCl 2 M; Espermidina 0,05% (p/v)] y 300 µL de ß- mercaptoetanol, incubándolos 5 minutos a 65ºC. Después se añadió 1 volumen de cloroformo:isoamílico (24:1) y se centrifugó durante 10 minutos, a 4.500 rpm y temperatura ambiente, recuperando la fase acuosa y un volumen de cloroformo:isoamílico (24:1). Se repitió la centrifugación en las mismas condiciones y de nuevo el lavado con cloroformo:isoamílico. Recuperada la fase acuosa, se añadieron 0,25 volúmenes de LiCl 10 M y se dejaron precipitando a 4ºC toda la noche. Las muestras fueron centrifugadas durante 20 minutos, a 7500 rpm y 4ºC, eliminando todo el sobrenadante. A continuación la extracción el RNA extraído fue purificado mediante el Kit “Qiagen RNeasy Plus” el cual incluye el tratamiento con DNasa. La cuantificación del RNA se realizó por duplicado con el espectrofotómetro Nanodrop ND-100 (Nanodrop
tecnologies)
4.1.2- Extracción de RNA total de Arabidopsis.
Se utilizó el método de extracción de fenol/cloroformo, seguido de precipitación con LiCl 1,5 M, descrito por Berrocal-Lobo et al., 2002. Al material homogeneizado (0.5 g) en nitrógeno líquido se le añadió 1 volumen de tampón de extracción [Tris-HCl 0,2 M, pH 9,0; EDTA 25 mM, LiCl 0,4 M, SDS 1% (p/v)] y 1 volumen de fenol, aplicando agitación durante 10 segundos y dejando incubar en hielo unos minutos, repitiendo la agitación hasta asegurar una muestra homogénea. Se centrifugó la muestra durante 2 minutos, a 14.000 rpm y temperatura ambiente. Se recogió la fase acuosa, a la que se añadió 1 volumen de fenol. Se repitió la centrifugación y se recuperó la fase acuosa, añadiendo 1 volumen de cloroformo y volviendo a centrifugar. A la fase acuosa recuperada se añadieron 0,3 volúmenes de LiCl 8 M, mezclando bien e incubando durante 2 horas a 4ºC. Tras la incubación, se centrifugó la muestra 30 minutos a 14.000 rpm 4ºC, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo en 0,5 volúmenes de agua. A la
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muestra resuspendida se le añadieron 1:10 volúmenes de acetato sódico 3 M, pH 5,2, y 2 volúmenes de etanol frío (-20ºC). Se precipitaron los ácidos nucleicos durante toda la noche a - 20ºC. Al día siguiente se centrifugó 20 minutos, a 14.000 rpm y 4ºC, y el precipitado se lavó con etanol 70% frío (-20ºC). Se volvió a centrifugar y se dejó secar al aire para eliminar los restos de etanol. El RNA se resuspendió en agua y se conservó a -80ºC.
4.2-
Tratamiento con DNAsas y síntesis de cDNA.
Las muestras de RNA total de Arabidopsis fueron tratadas con TURBO DNA-free kit
(Ambion-Applied Biosystems) para eliminar restos de DNA genómico. Se utilizó siguiendo las instrucciones recomendadas por el fabricante para “tratamientos rigurosos de DNA”. El cDNA se sintetizó a partir de 1,5 µg de RNA en 30 µL de reacción del kit PrimeScriptTM RT reagent (Perfect
Real Time) de Takara en presencia de los cebadores “Oligo dT” y “Random 6 mers”, en las
cantidades recomendadas por el fabricante, con una incubación de 90 minutos a 37ºC.
4.3-
Métodos de extracción de DNA.
4.3.1- Extracción de DNA genómico de especies arbóreas.
Previo a la extracción de DNA, el material fue molido en nitrógeno líquido. Se partió de 100 mg de pulverizado conservado a -80ºC y se extrajo con DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen®),
siguiendo las instrucciones del fabricante.
4.3.2- Aislamiento de DNA plasmídico.
Para el aislamiento a pequeña escala de plásmidos replicados en E. coli, se utilizó el
QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen), siguiendo las instrucciones del fabricante. El aislamiento a gran
escala de plásmidos se realizó mediante el Qiagen Plasmid Maxi kit (Qiagen). El método se basa en la lisis alcalina de células bacteriales seguida por la adsorción de DNA a una resina en presencia de una elevada concentración de sales.
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4.4-
Electroforesis de ácidos nucleicos.
Los fragmentos de DNA se separaron mediante electroforesis en geles horizontales de agarosa al 1% (p/v) en tampón TBE (Tris-bórico 90 mM; EDTA 2 mM). Las muestras se mezclaron con tampón de carga [azul de bromofenol 0,05% (p/v); glicerol 5% (p/v)]. Los voltajes empleados variaron de los 80V a los 120V en función del tamaño del gel. El DNA se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio (0,5 µg/mL) en un trasiluminador Molecular Imager Gel Doc XR System (Bio-Rad) asociado al software Quantity One 4.6.5 (Bio-Rad).
Las muestras de RNA se separaron de manera rutinaria en geles de similares características a los empleados para DNA. Para electroforesis de alta resolución se utilizaron geles de agarosa 1% (p/v) en tampón MOPS [MOPS 20 mM, acetato sódico 5 mM, EDTA 0,5 mM, pH 7,0 con NaOH] y formaldehído 2,2 M. Las muestras se mezclaron con tampón de carga [3 µL formaldehído 37%; 8 µL Formamida; 2 µL MOPS 10x; 1µL azul de bromofenol; 1 µL bromuro de etidio (10mg/mL)] y se calentaron a 65ºC durante 10 minutos, enfriándolas inmediatamente después en hielo durante 5 minutos. La electroforesis se realizó en geles de 6 x 10 cm, con una diferencia de potencial de 65 V constantes durante dos horas.
4.5-
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
4.5.1- Reacción en cadena de la polimerasa estándar.
En cada reacción se añadieron oligonucleótidos a una concentración final de 0,2-2,0 µM, dNTPs 200 µM, MgCl2 2 mM, BSA 0,4 mg/mL y Taq DNA polimerasa (Biotools), 0,8 U/25 µL
de reacción, en el tampón suministrado por el fabricante a una concentración final de 1x. En algunos casos fue necesaria la utilización de LongRange PCR kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Como molde se utilizaron cantidades variables de DNA, basadas en resultados empíricos y en ajustes para cada reacción.
En todos los casos, la PCR se llevó a cabo en un termociclador Thermal Cycler 2720 de Applied Biosystems. Los oligonucleótidos y las condiciones utilizadas para la reacción en cada caso concreto se detallan más adelante. Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa (apartado 4.4)
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4.5.2- Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR). 4.5.2.1- Diseño de Oligonucleótidos.
Se diseñaron oligonucleótidos para los genes diana y para el gen 18 utilizado como control, a partir de las secuencias codificantes teniendo en cuenta que la temperatura de unión estuviera alrededor de 60ºC, el tamaño ideal de los fragmentos amplificados fuera entre 100-150 pb, y que la especificidad en los análisis BLAST de las bases de datos fuera elevada. Fueron diseñados con ayuda del programa Primer 3 o manualmente y evaluados con Oligo Analyzer 1.0. Las secuencias de los mismos se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 4. Oligonucleótidos utilizados en el desarrollo de esta tesis. Oligonucleótidos específicos
diseñados para el análisis cuantitativo de la expresión de genes de chopo, nogal y arabidopsis mediante RT- qPCR.
Nombre Secuencia (5’-3’) Gen
Genes utilizados como control
Pt18S fw AAACAAGGAGTAACCACGG
18Sr RNA Pt (AF206999) y At
(X16077)
Pt18S rv AAGTATCGCATTTCGCTA
Ju18S fw TCAACTTTCGATGGTAGGAT 18S ribosomal nogal (AF206943)
Ju18S rv CCGTGTCAGGATTGGGT
Genes identificados a partir de geles 2D
qPCR ferrit fw TTCTTGTTCTTCTGTTTCAGCC Ferritina (Potri.006G103900)
qPCR ferrit Rv CAAAGACCTCCTTCTTCACC qPCRGluSfw CTTATCAACCTTAACCTTTCCG Glutamina sintetasa ( Potri.017G131100) qPCRGluSrv ACCATCATAGTTCCACTTGGG qpCR PsbP fw TGCACTAACCACTCCTGCC Psbp (Potri.002G055700) qpCR PsbP rv AATCTACGAGACACAACACCG qpcr SDR1F GCTCTGGTGACTGGAGGG SDR (Potri.008G149200) qpcr SDR1R CCTTCAGTAGCATCTTTAGGG
Rt PPOf TCCACCTCCTCTCTGTGCC PPO (Potri.001G388900)
Rt PPOr TAGACCAATGAGGACATCCC
Qpcr bicupin Fw CCAAGGTATCATGGGAGGG Bicupina (Potri.001G402600)
Qpcr bicupin Rv TCAACAATTTCCGTGTTAGGG
qPCR SODfw CCACGCAATCCTCACAGCC SOD (Potri.004G216700)
qPCR SODrv GAGGTTGCTGCTTCTTGGC
qPCR TIMfw GCTCTCAACTTCACTCTCCG TIM (Potri.004G168000)
qPCR TIMrv AGAAGCGAAGAAAAGACTGGG
qPCR thaufw pt TTTGCTGCCCTTCATTTCCC Taumatina (Potri.001G107800)
qPCR thaurv pt CTAATGGTCCATGTCTCACC
HSP fw ATGTCTCTGATTCGATCATTGC sHSP (Potri.006G093500)
HSP rv GCGAAACTTGATATCTCATTAGTAC
Genes implicados en la respuesta a herida
ptchit_f GAGATTGCTGCTTTCCTGGG Quitinasa (Potri.009G141800)
ptchit_r CATTGATAGTTGGAAGATGGG
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rtPPO1r GGTCAGCAAGATTGGTAGCG
Genes PPO de populus y nogal
rtPPO1f GTCCACCTTATCTTTCAGTCC PtrPPO1 (Potri.011G108300)
rtPPO1r GGTCAGCAAGATTGGTAGCG
rtPPO2-5-12-14-16f ATCTGCTCATTGGTCTCGGTG PtrPPO2, PtrPPO5, PtrPPO12,
rtPPO2-5-12-14-16r GATCTTTGTGGATGTTTGAGGG PtrPPO14, PtrPPO16
rtPPO3f GGAGTGGCACAGACACCC PtrPPO3 (Potri.011G047300)
rtPPO3r AATTGGACCTGGTTCAGGG
rtPPO7f TTAGACAGGTAATAAATGACGC PtrPPO7 (Potri.001G0388300)
rtPPO7r TAAGCACCATCACAATAAGCG
rtPPO9f GCCTTTGCCATACCTCCG PtrPPO9 (Potri.001G0388100)
rtPPO9r CCACAAGTCCCACATTCGG
rt PPOf TCCACCTCCTCTCTGTGCC PtrPPO11 (Potri.001G388900)
rt PPOr TAGACCAATGAGGACATCCC
rtPPO13f GACTACAGTTGTACTACGCC PtrPPO13 (Potri.004G156500)
rtPPO13r GCAGCCCATGAAGAGTTCC
rtJgPPOf AGGATGACGCACCAACCG JuPPO1 (FJ769240)
rtJgPPOr ACCAAAGTCACCACCACGG
Para la amplificación de las sHSPs fueron utilizados los oligonucleótidos diseñados por Merino et al., 2004.
4.5.2.2- Protocolo.
Las PCRs en tiempo real se llevaron a cabo en el termociclador “ABI PRISM 7300” (Applied Biosystems). Todas las reacciones fueron realizadas en un volumen final de 20 µL conteniendo 10 µL de la mezcla SYBR® Green 2X (Applied Biosystems), 0,2 µM de cada
oligonucleótido, y 1 µL de cDNA (apartado 4.2). Para los genes control se utilizó el cDNA a una dilución 1:100. Los ciclos de amplificación consistieron en un ciclo inicial de 2 minutos a 50ºC, un ciclo de desnaturalización de 10 minutos a 95ºC, seguido por 40 ciclos de amplificación de 15 segundos a 95ºC y 1 minuto a 60ºC y un ciclo de disociación de 15 segundos a 95ºC para asegurar la presencia de un solo amplicón. Los datos fueron exportados desde el software 7300 Real-Time PCR System.
Para el análisis de los niveles de expresión se realizó una cuantificación relativa del gen de estudio, usando el método Ct (2-∆∆Ct) expuesto por Livak y Schmittgen, 2001. Los valores
reflejados se han basado en los resultados obtenidos en tres experimento independientes, cada uno con dos muestras.
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4.6-
Secuenciación.
La secuenciación de DNA se realizó en el Servicio de secuenciación del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (C.N.I.O), mediante el sistema ABI Prism (Applied Biosystems) de terminadores fluorescentes Big DyeTM y un instrumento de electroforesis multicapilar ABI 3730.
4.7-
Purificación de muestras de DNA.
Para la eliminación de oligos en productos de PCR, y limpieza genérica de DNA, se utilizó el QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Para purificar fragmentos de interés de digestiones de DNA, así como de PCRs con amplificaciones inespecíficas, las muestras fueron separadas en geles de agarosa, extrayendo con un bisturí el fragmento elegido del gel y purificándolo mediante
el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). En ambos kits se siguieron las instrucciones del fabricante,
excepto en el volumen de resuspensión, que fue de 30 µL H2O.