Analysis of CLJP

La presente investigación experimenta requirió de la realización de un ensayo piloto el cual fue desarrollo en el laboratorio de investigación de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Señor de Sipán (Anexo 1, 2 y 3). Sin embargo, la ejecución se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad César vallejo Filial Piura (Anexo 4). Esto debido a que la temática de la investigación requería el asesoramiento de un profesional microbiólogo especialista que valida científica y metodológicamente la parte procedimental de la investigación (Anexo 5).

2.4.1.2. De la adquisición de las pastas dentales

Las pastas dentales también denominadas comercialmente como cremas dentales fueron adquiridas en los supermercados “Tottus” y “Metro” de la provincia de Chiclayo-Perú a partir de su nombre comercial y su descripción en el empaque. Dos con denominación de herbales (Family Doctor® y Precio UNO®) y dos no herbales (Crest, anticaries® y Closeup, acción profunda®). Antes de su adquisición se verificó la fecha de vencimiento y la integridad del empaque y del producto. Una vez adquiridos fueron transportados al laboratorio para su procesamiento. (Anexo 6)

2.4.1.3. Del procesamiento de las pastas dentales

El procesamiento de las pastas dentales fue llevado a cabo en el laboratorio de microbiología de la Universidad César Vallejo Filial Piura. Consistió en el desempacamiento de las pastas dentales y su dilución con una concentración conocida de agua destilada estéril (10 g de pasta dental en 50 mL de ADE). Este procedimiento se realizó en frascos de boca ancha estériles para de esta manera garantizar la fluidez de la pasta dental tanto en los discos de difusión como en los pocillos (Anexo 7).

77 2.4.1.4. De la preparación del medio de cultivo

Se utilizó el Agar Mitis Salivarius Bacitracina que según estudios previos es un medio selectivo y eficaz para el desarrollo de

Streptococcus mutans. Este medio permitió el desarrollo eficiente de la

bacteria, así como permitió caracterizar fenotípicamente a las colonias bacterianas evitando una posible contaminación (Anexo 8).

2.4.1.5. De la adquisición de la cepa Bacteriana

La cepa certificada de Streptococcus mutans ATCC 25175 fue adquirida de la empresa Genlab^® (Anexo 9).

2.4.1.6. De la reactivación de la cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175 La cepa de S. mutans ATCC 25175 fue adquirida de forma liofilizada. Por lo que fue necesaria su reactivación. Esta se llevó acabo en caldo soya tripticasa (Merck^®) para ello se retiró el vial del empaque de almacenamiento y se colocó sobre una gradilla a temperatura ambiente (aproximadamente 25°C). Una vez alcanzada la temperatura y en condiciones de esterilidad se procedió a incorporar dentro del vial un mL de caldo soya tripticasa y se llevó a incubar a 36 °C en condiciones de microaerofilia durante 14 horas después de las cuales con un hisopo estéril se tomó la suspensión bacteriana del vial y se sembró por dispersión agar mitis salivarius bacitracina para la observación de las características culturales de la cepa (Anexo 9).

2.4.1.7. De la estandarización del inóculo bacteriano

A partir de las unidades formadoras de colonias (UFC) que desarrollaron en la placa con agar mitis salivarius bacitracina se procedió a preparar suspensiones bacterianas en solución salina fisiológica estéril con la finalidad de estandarizar el inóculo bacteriano a la concentración de 1,5 x 10⁸ UFC/mL (05 del nefelómetro de McFarland). La estandarización se hizo espectrofotométricamente con una absorbancia de 0,09 a 625 nm de longitud de onda. Es procedimiento se realizó inmediatamente antes de la ejecución de la investigación (Anexo 9).

78 2.4.1.8. De la evaluación del efecto antibacteriano de las pastas dentales

Tanto el método de difusión en disco como el método del pocillo de agar son métodos estandarizados recomendados por La Clinical and Laboratory Standards Institue (Anexo 10).

2.4.1.8.1. Método de difusión en disco

Se sirvieron placas petri con agar mitis salivarius bacitracina. Las placas petri fueron de vidrio con un diámetro de 100 mm y 15 mm de altura. La proporción del medio de cultivo fue de 15 mL. Una vez servidas las placa petri fueron colocadas en estufa a 37 °C durante 15 minutos para garantizar el secada de su superficie. Secas las placas se procedió a la siembra del inóculo por dispersión en superficie con hisopo estéril. Una vez inoculadas todas las placas se procedió a colocar discos de papel de filtro Whatman estéril con un diámetro de 6 mm. Se colocaron cuatro discos equidistantes por placa. Posteriormente con ayuda de una micropipeta se le incorporó 15 µL de cada pasta dental que se había preparado previamente. Cuando los sistemas ya estaban preparados se dejaron reposar durante 30 minutos de forma horizontal sobre la superficie de la mesa del laboratorio hasta asegurar la difusión de las pastas dentales. Después del tiempo transcurrido fueron invertidas e incubadas en estufa microbiológica a 36 oC durante 24 horas para su posterior lectura de resultados (Anexo 10).

2.4.1.8.2. Método del pocillo de agar

El método del pocillo de agar difiere del método de difusión en disco solo en el proceso de colocación de discos. En lugar de la colocación de éstos, con ayuda de un sacabocado estéril con un diámetro interior de 6 mm se procedió a retirar cuatro cilindros de agar de manera equidistante (semejante a la distancia a la que fueron colocadas los discos en el método descrito anteriormente). Una vez formados los pocillos con ayuda de una micropipeta de rango variable se incorporó 25 µL del preparado de las pastas

79 dentales. Los pasos siguientes fueron los mismos que el método de difusión en disco (Anexo 10).

2.4.1.9. De la lectura de resultados

Los resultados consistieron en la medición de los halos de inhibición formados alrededor de los discos y pocillos con las pastas dentales evaluadas. La medición se realizó con un vernier milimétrico mecánico (Anexo 11).