Approach Architecture

- Medio de cultivo M1: MEM (Gibco-Invitrogen) con 10% de suero fetal bovino (Gibco-Invitrogen) inactivado por calor durante 30 min a 56ºC (FBS- HI), 2% de glucosa y 100 ng/ml de NGF.

- Medio de cultivo E2F: MEM con 1% de suplemento N-2 (Gibco-Invitrogen), 2% de glucosa, 100 ng/ml de NGF y 8 µM de 5-Fluoro- 2’-deoxiuridina en combinación con 4 µM de Uridina (ambos de Sigma-Aldrich).

- Medio de proliferación de cocultivos: DMEM/F- 12 con 1 mM L-Glutamina, 1% de suplemento N- 2, 2% de glucosa y 100 ng/ml de NGF.

- Medio de cultivo definido “Sato”: DMEM/F-12 (Gibco-Invitrogen) suplementado con 1 mM L- Glutamina (Gibco-Invitrogen), 100 μg/ml de transferrina bovina (Gibco-Invitrogen), 5 μg/ml de insulina, 10,1 ng/ml de triyodotironina (T3), 0,4 μg/ml de tiroxina (T4), 160 ng/ml de selenio, 38 ng/ml de dexametasona y 60 ng/ml de progesterona (todos procedentes de Sigma- Aldrich) (Meintanis et al., 2001).

- Tampón PBS: 10 mM de Na2HPO4, 1,76 mM de

KH2PO4, pH 7,4, 136 mM de NaCl y 2,7 mM de

KCl.

- Tampón Versene: 18,76 mM de Na2HPO4, 1,46

mM de KH2PO4, pH 7,4, 136 mM de NaCl, 2,7

mM de KCl y 0,77 mM de EDTA.

- Tampón RIPA: 50 mM de Tris-HCl, pH 8, 150 mM de NaCl, 2 mM de EDTA, 2 mM de Na3VO4,

2,5 mM de NaF, 0,5% de deoxicolato sódico (Sigma-Aldrich), 1% de Nonidet P-40 (Roche) y 0,1% de SDS (Sigma-Aldrich). Se añade una pastilla de inhibidor de proteasas cOmplete® (Roche) por cada 50 ml de tampón, justo antes del uso.

- Tampón de carga “Laemmli”: 63 mM de Tris- HCl, pH 6,8, 10% de Glicerol, 2% de SDS, 0,0025% de azul de bromofenol (Sigma-Aldrich); suplementado con 0,1 M de DTT (Sigma-Aldrich) cuando se utiliza en condiciones reductoras. El stock se prepara habitualmente como 6X.

- Tampón de carrera de electroforesis: 25 mM de Tris Base (Sigma-Aldrich) y 192 mM de Glicina (Bio-Rad), pH 8,6-8,8, con 0,1% de SDS.

- Tampón de transferencia de electroforesis: 25 mM de Tris Base y 192 mM de Glicina, pH 8,6- 8,8, con un 20% de metanol (Merck).

- Tampón TBS: 20 mM de Tris-HCl, pH 7,6 y 136 mM de NaCl.

- Tampón T-TBS: TBS con 0,05% de Tween-20 (Sigma-Aldrich).

- Solución de bloqueo para WB: 5% de leche de vaca desnatada en polvo (La Asturiana) en T-TBS.

- Solución de anticuerpos primarios para WB: 5% de BSA (Sigma-Aldrich) en T-TBS.

- Tampón de lisis para IP: PBS, pH 7,4, con 1% de Tritón X-100 conteniendo inhibidor de proteasas cOmplete® (una tableta por cada 50 ml).

- Tampón NETN: 20 mM de Tris-HCl, pH 8, 100 mM de NaCl y 1 mM de EDTA, con 1% Tritón X- 100 (Sigma-Aldrich) y 1% Sarkosyl (N- Laurylsarcosine sodium salt, Sigma-Aldrich), con 1 mM de DTT e inhibidor de proteasas cOmplete® (una tableta por cada 50 ml).

- Tampón PBS-Ca-Mg: PBS, pH 7,4, con 0,9 mM de CaCl2 y 0,5 mM de MgCl2.

- Tampón ABS (Antibody Blocking Solution): 50 mM de Trizma Base (Sigma-Aldrich), pH 7,4,

150 mM de NaCl, 1% de BSA, 100 mM L-Lisina (Sigma-Aldrich).

- Tampón MRB (Medium Restricted Buffer) 10X: 100 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM de NaCl; 100 mM de MgCl y 10 mM de DTT.

3. Anticuerpos.

- Para la detección de p75NTR se utilizaron dos anticuerpos diferentes. Para WB se utilizó un anticuerpo policlonal generado en conejo (Upstate) preparado a una dilución de 1:1000. Por otro lado, la visualización en inmunofluorescencias así como la inmunoprecipitación se llevó a cabo con el anticuerpo monoclonal MC192. Dicho anticuerpo se produjo en el laboratorio, a partir de su hibridoma (Chandler et al., 1984). Para ello, se cultivaron las células en suspensión en medio RPMI (Gibco-Invitrogen), suplementado con 10% de FBS-HI, en frascos de cultivo (Falcon). Una vez crecidas, se sustituyó el medio por RPMI sin suero durante 10 días para estimular la secreción del anticuerpo al medio. Posteriormente se recogió el cultivo, se centrifugó y el sobrenadante fue sometido a una precipitación por sulfato amónico saturado, según el método descrito en (Harlow and Lane), seguido de su resuspensión en PBS y posterior diálisis contra PBS en condiciones ácidas (en presencia de 0,1% de ácido acético), quedando una concentración final aproximada de anticuerpo de 0,05 µg/µl, que fue determinada por comparación frente a un patrón realizado con inmunoglobulinas de concentración conocida, separadas electroforéticamente mediante SDS- PAGE y teñidas con Coomasie Brilliant Blue (Bio-

Rad). Las diluciones empleadas fueron 1:100 para IF y 2 µg/ml para IP.

- Para el reconocimiento de CypB se empleó un anticuerpo policlonal de conejo (Abcam), usado a diluciones 1:1000 en WB y 1:250 en IF. En el caso de CypA el anticuerpo utilizado fue un policlonal de conejo (Upstate) a diluciones 1:1000 en WB y 1:250 en IF.

- El estudio del receptor de neurotrofinas TrkA se llevó a cabo con diversos anticuerpos. Para reconocer la forma fosforilada de la proteína se utilizaron los anticuerpos policlonales de conejo Phospho-TrkA (Tyr490) y Phospho-TrkA (Tyr674/675), del PhosphoPlus TrkA Antibody Kit (Cell Signaling Technology), ambos a una dilución 1:1000. Para el análisis de la proteína total en WB se utilizó el anticuerpo policlonal de conejo RTA [rat trkA, proporcionado por L. Reichardt (Clary et al., 1994)], a una dilución de 1:1000. En IF el anticuerpo de elección fue un monoclonal de ratón anti-Trk (Zymed, Invitrogen Inmunodetection), diluido 1:200.

- Para analizar la señalización secundaria de rutas ERK se recurrió a varios anticuerpos: para detectar la forma fosforilada de ERK 1/2 se usó el anticuerpo monoclonal de ratón E-4, (Santa Cruz Biotechnology) a una dilución de 1:1000 en WB; mientras que para observar la cantidad total de ERK se usaron dos anticuerpos distintos, un policlonal de conejo contra ERK 1/2 (Cell Signaling Technology) a 1:1000, y un policlonal de conejo frente a ERK 2 C-14 (Santa Cruz Biotechnology) a 1:2000.

- En el marcaje de proteínas de mielina se usaron los anticuerpos señalados a continuación. En el caso de MAG fue usado un anticuerpo monoclonal de ratón (Chemicon). Para detectar P0 se usó un

anticuerpo monoclonal de ratón (Astexx). En el reconocimiento de MBP se empleó un anticuerpo policlonal de conejo (Chemicon). En todos los casos se diluyeron 1:500 para IF y 1:1000 para WB.

- Para visualizar axones en IF se empleó un anticuerpo policlonal de conejo contra cadena pesada de Neurofilamento 200 (Sigma-Aldrich), a una dilución de 1:500.

- El anticuerpo de elección para el reconocimiento de NFATc1 fue un monoclonal de ratón (Alexis Biochemicals), diluido 1:1000, que permite distinguir las formas fosforiladas y no fosforiladas en función de su diferente movilidad electroforética. También se utilizaron anticuerpos frente a NFATc2 (suministrado por E. Cano y J.M. Redondo (Cano et al., 2005)) y NFATc3 (M-75 de Santa Cruz Biotechnology), ambos a una dilución 1:1000, aunque no se pudo detectar su expresión en las líneas y tipos celulares utilizados.

- Para la inmunodetección de GST se empleó el anticuerpo policlonal de conejo Z-5 (Santa Cruz Biotechnology), diluido 1:1000.

- Para el reconocimiento de ß-actina se recurrió a un anticuerpo monoclonal directamente conjugado con HRP (Sigma-Aldrich), preparado a una dilución 1:10000. En este caso particular, el anticuerpo fue diluido en TBS con 0,1% Tween-20 y 5% de leche en polvo, y todos los

procedimientos (bloqueo, incubación y lavados) fueron realizados a esa misma concentración, en lugar del 0,05% habitual.

4. Cultivos celulares.